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高脂樣本甘油檢測試劑盒說明書

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高脂樣本甘油檢測試劑盒(適用肝臟、脂肪細胞)

 描述:甘油是甘油三酯的水解產物。與游離脂肪酸一樣,甘油含量是甘油三酯水解反應的可靠檢測指標,但檢測更加方便。本試劑盒采用優化步驟,能夠檢測實體組織、細胞中的甘油含量,線性范圍為10-1200µmol/L

 原理:ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油,再被甘油磷酸氧化酶氧化產生過氧化氫;在過氧化物酶作用下生色底物轉化為苯醌亞胺,其光密度值與甘油濃度成正比。

 適用范圍:測定實體組織、細胞中的甘油濃度。

 組成 (105次微板測定或301 ml比色杯測定)

(1)    裂解液 100 ml   

(2)    R1試劑 16 ml

(3)    R2試劑  4 ml    

(4)    4 mmol/L甘油標準品1 ml

4 ºC保存  6個月有效

 所需設備:酶標儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計。佳工作波長550nm,如無此波長建議優先選用570nm、次選530、490nm。

  組織細胞裂解

細胞(包括分化的脂肪細胞)裂解:

消化、離心收集細胞?;蛑苯釉谂囵B皿內裂解。通常6孔板單孔約2x106個細胞,75cm2瓶約1x107細胞。按比例每1~2 x 106細胞加0.1ml裂解液,震蕩或渦旋裂解后,靜置10分鐘。

 動物組織裂解:

切記要預先將新鮮組織剪切稱重后再進行保存。組織凍存后再進行解凍、剪切、稱重可能會產生嚴重的測量誤差。離心管精確稱重,加入組織塊后再稱重,二者相減(即減量稱重法)計算組織重量(100mg)。強烈建議按比例每1mg組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質含量變異而產生的誤差。(注意;裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質提?。?。用電動高速勻漿器或手動玻璃勻漿器破碎組織。(不超聲方法,因其不能*和均勻破碎。應根據預實驗調整初始的組織細胞加入量),而后,靜置10分鐘。

 裂解液處理:

1.    取適量上清液轉移到1.5ml離心管中,進行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量或-20ºC儲存。

2.    70ºC 加熱10分鐘滅活脂肪酶,可能出現絮狀沉淀。

3.    室溫5000rpm離心5分鐘,上層清液即可用于酶學測定。

 

 工作溶液配制:4:1比例,取4 ml試劑R11 ml試劑R2混合即可,立即使用或4ºC保存<1天,變色棄去。(注意:謹防來源不明但容易發生的甘油污染,可來自操作者本人或標準品液體微粒濺射等。)

 

 標準品稀釋:用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體,將4 mM甘油標準品倍比稀釋為1000、500250125、62.531.2515.625、7.8125 µmol/L,通常取其中4~6管即可,注意設置0濃度對照反應管。

 

 甘油測定

1.    參見下表加樣。待測樣品體積10µl,多加可能會抑制反應。

2.    37ºC25ºC反應 10分鐘。反應平衡后顏色在60分鐘內穩定。

3.    先用蒸餾水+工作液的空白管調零,然后測定各管OD值。

4.    繪制標準曲線并計算甘油濃度。

Excel作圖步驟:各標準管OD值為y軸,標準品濃度為x軸。(1)鼠標左鍵圈住數據,點擊做圖向導,選擇-散點圖-,點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點,點擊-添加趨勢線-,點擊-選項-,點擊-顯示公式--R2-

5.    以每mg蛋白濃度或細胞數校正甘油含量。

加樣表(可對樣品和工作液比例進行微量調整)

 

96孔微板測定

1 ml比色杯測定

 

空白管

標準品

樣品

空白管

標準品

樣品

蒸餾水µl

10

 

 

35

 

 

標準品µl

 

10

 

 

35

 

樣品µl

 

 

10

 

 

35

工作液µl

190

190

190

665

665

665

 

 

 

說明:

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。

2. 紅細胞糖酵解時合成磷酸甘油影響測定。

 

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