基本原理：
外源目的DNA與載體分子的連接稱為DNA重組，重組的DNA稱為重組體或重組子。研究中需要克隆或表達的基因為外源DNA，載體是指能夠攜帶外源基因進入受體細胞，并在其中進行擴增或誘導外源基因表達的工具，其中質粒載體最為常用。
質粒是獨立于細菌染色體外具有自我復制的DNA分子。所有的質粒都有復制子、選擇性標志和多克隆位點3個共同的特性。質粒載體的選擇包括載體的大小、載體拷貝數、多接頭以及篩選插入片段的能力，pcDNA3.1（+/-）是比較常用的真核表達載體。

基本步驟：
1、目的DNA片段的獲得。這一步驟中，可以選擇通過設計引物進行PCR擴增來獲得目的DNA片段，也可以通過化學合成的方法來獲得目的DNA片段，這里值得注意的點，目的DNA片段5'和3'端需要引物合適的酶切位點，方便后續與質粒載體的連接。
2、目的DNA片段與質粒連接。通過選擇的酶切位點將環形的質粒酶切成線性，與目的DNA片段進行連接反應，而后轉化至大腸桿菌感受態細胞中，進行培養。
3、連接產物轉化及鑒定。挑選2-3個單克隆置于含有抗性的液體培養基中進行擴大培養。提取質粒進行雙酶切鑒定，雙酶切后電泳，能夠看到存在與目的DNA片段大小一致的條帶，說明此單克隆插入了目的DNA片段，而至于目的DNA片段中堿基序列是否存在突變點，需進行一代測序驗證。只有同時滿足雙酶切鑒定大小合適并且測序后DNA堿基序列*一致的單克隆菌才被認定為構建成功的重組子。
4、鑒定正確的重組質粒擴大培養及保種。將上述構建成功的重組子質粒菌種再一次擴大培養，提取重組子質粒以及進行保種，方便后續實驗使用。
值此，包含此外源DNA的重組DNA的構建算全部完成。

注意事項及心得體會：
1、目的DNA片段獲取過程中，如果選擇通過設計引物進行PCR擴增方法來獲得，建議選擇高保真的酶來進行擴增反應，這樣在一定程度上可以降低因為擴增反應而產生的堿基引入錯誤。
2、PCR產物和酶切產物盡量不要放置時間過長，最好是即時進行連接。
3、連接體系中載體與目的基因的分子數比例，需要摸索合適的比例，一般為1:3--1:10，合適的比例能夠提高連接效率。

重組DNA的構建（載體構建）

會員登錄

收藏該商鋪

提示