化工儀器網(wǎng)>產(chǎn)品展廳>試劑標(biāo)物>行業(yè)專(zhuān)用試劑>生化與分子生物學(xué)用試劑>免疫印跡Western Blot 代做免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)
免疫印跡Western Blot 代做免疫印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)
| 參考價(jià) | ￥ 150 |
| 訂貨量 | ≥1 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
- 公司名稱(chēng) 上海維景生物科技有限公司
- 品牌
- 型號(hào) 免疫印跡Western Blot
- 產(chǎn)地 上海
- 廠商性質(zhì) 代理商
- 更新時(shí)間 2023/6/15 11:02:19
- 訪問(wèn)次數(shù) 2162
產(chǎn)品標(biāo)簽
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標(biāo)簽抗體偶聯(lián)beads，標(biāo)簽抗體，內(nèi)參抗體，WB實(shí)驗(yàn)服務(wù)，IP實(shí)驗(yàn)服務(wù)，ChIP實(shí)驗(yàn)服務(wù)
代做Western Blot實(shí)驗(yàn)，代做免疫印跡實(shí)驗(yàn)
Western Blot標(biāo)準(zhǔn)protocol
成功完成Western Blot檢測(cè)，必須滿(mǎn)足4個(gè)條件：
- 凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來(lái)，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析
- 吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過(guò)程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析
- 處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過(guò)程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上
- 處理過(guò)程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測(cè)試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無(wú)法檢測(cè)
成功進(jìn)行WB檢測(cè)，則設(shè)置合適正確的對(duì)照是*的，只要正確設(shè)置了這些對(duì)照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問(wèn)題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對(duì)照如下：
- 陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的工作效率
- 陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性
- 二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性
- 內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
- 空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果
WB檢測(cè)基本過(guò)程
1、獲取細(xì)胞或組織裂解物
1）根據(jù)檢測(cè)蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
| 蛋白位置 | *buffer |
| 全細(xì)胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞漿（骨架結(jié)合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
| 線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購(gòu)買(mǎi)商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來(lái)保證標(biāo)本制備的質(zhì)量
2）選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性！
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質(zhì)
根據(jù)待測(cè)蛋白狀態(tài)確定電泳條件：
| 待測(cè)蛋白狀態(tài) | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
| Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據(jù)待測(cè)蛋白分子量大小確定凝膠濃度
| 蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
4、轉(zhuǎn)膜
根據(jù)不同的檢測(cè)目的和待測(cè)蛋白的特性，選擇合適的膜類(lèi)型。常用的轉(zhuǎn)移膜類(lèi)型有：PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：
| | PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
| 靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 較高 |
| 蛋白結(jié)合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時(shí)與蛋白結(jié)合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 機(jī)械強(qiáng)度 | 強(qiáng) | 干的膜易脆 | 軟而結(jié)實(shí) |
| 溶劑抗性 | 強(qiáng) | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸潤(rùn) | *甲醛潤(rùn)濕 | 緩沖液潤(rùn)濕 | 緩沖液潤(rùn)濕 |
| 適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
| 適用檢測(cè)方法 | 顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測(cè) | 顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性 | 顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性 |
| 適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測(cè)、蛋白質(zhì)測(cè)序、氨基酸分析、重復(fù)檢測(cè) | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復(fù)檢測(cè)。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測(cè)常用 |
| 價(jià)格 | 高 | 較低 | 低 |
5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)：
- 選擇適合檢測(cè)標(biāo)本種屬的一抗（說(shuō)明書(shū)有驗(yàn)證）
- 選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說(shuō)明書(shū)有驗(yàn)證）
- 選擇單克隆抗體或者經(jīng)過(guò)親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
- 根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。
- 抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過(guò)2周
- 根據(jù)說(shuō)明書(shū)*濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)方法等的差異，說(shuō)明書(shū)*的稀釋比例只作參考，需要在說(shuō)明書(shū)*的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有*濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。
- 孵育條件：*4°C孵育過(guò)夜（一般大于18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別
內(nèi)參的選擇和使用：WB過(guò)程監(jiān)測(cè)以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！
WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)：
| 內(nèi)參名稱(chēng) | 分子量大小 | 適用范圍 |
| beta-actin | 43kDa | 胞漿和全細(xì)胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞漿和全細(xì)胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞漿和全細(xì)胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 線粒體 |
| COXIV | 16kDa | 線粒體 |
| TBP | 38kDa | 細(xì)胞核 |
7、二抗孵育
根據(jù)說(shuō)明書(shū)*濃度使用TBST稀釋一抗。如果說(shuō)明書(shū)沒(méi)有*濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)
8、底物孵育
選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量
9、結(jié)果分析和檢測(cè)
凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開(kāi)始，每步之間都需要用TBST進(jìn)行洗滌，3次，每次5min
上海維景生物科技有限公司是一家專(zhuān)注生命科學(xué)領(lǐng)域的企業(yè)，借助中科院細(xì)胞與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，擁有強(qiáng)大的資金背景支持和專(zhuān)業(yè)的團(tuán)隊(duì)等資源。公司面向全國(guó)市場(chǎng)，迅速發(fā)展，廣納英才，現(xiàn)已建成專(zhuān)業(yè)生命科學(xué)產(chǎn)品銷(xiāo)售團(tuán)隊(duì)，其中大部份是在生命科學(xué)市場(chǎng)上工作多年，有豐富的銷(xiāo)售經(jīng)驗(yàn)，也有良好的客戶(hù)資源，銷(xiāo)售渠道全面覆蓋華東大部分工業(yè)以及科研客戶(hù)，團(tuán)隊(duì)中免疫學(xué)及相關(guān)專(zhuān)業(yè)碩士以上學(xué)歷人士達(dá)50%，有較強(qiáng)的能力，在針對(duì)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)中能夠提供完善周到的專(zhuān)業(yè)化服務(wù)，對(duì)客戶(hù)在使用產(chǎn)品過(guò)程中提出的問(wèn)題能滿(mǎn)意答復(fù)，并可及時(shí)傳遞的產(chǎn)品技術(shù)資料信息。
上海維景生物科技有限公司憑借優(yōu)質(zhì)的技術(shù)服務(wù)平臺(tái)和專(zhuān)業(yè)的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)，維景生物傾情打造zui高質(zhì)量的技術(shù)服務(wù)。至今，已為廣大科研客戶(hù)和合作伙伴提供了實(shí)時(shí)定量 PCR、細(xì)胞凋亡、 Western-blot 、 Elisa 、免疫組化、原位雜交、質(zhì)粒載體的構(gòu)建、穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選、 siRNA干擾效率的鑒定、雙螢光報(bào)告系統(tǒng)、蛋白表達(dá)及純化、腺病毒 / 腺相關(guān)病毒 / 慢病毒的包裝服務(wù)、單多克隆抗體的制備、 SCI文章的修改及發(fā)表服務(wù)等。
生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目列表
預(yù)實(shí)驗(yàn)免費(fèi)！常用抗體免費(fèi)！
分子克隆技術(shù)服務(wù)：載體構(gòu)建、定點(diǎn)突變、RT-PCR、熒光定量PCR、SNP分型等；
蛋白免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)服務(wù)：Western Blot檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)、流式檢測(cè)與分選，細(xì)胞凋亡檢測(cè)與分析、抗體制備等。
細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)服務(wù)：細(xì)胞培養(yǎng)、原代培養(yǎng)、細(xì)胞株構(gòu)建、三維培養(yǎng)、病毒包裝（慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄和腺病毒）、細(xì)胞分選與培養(yǎng)、細(xì)胞侵襲與催化、共聚焦檢測(cè)等技術(shù)
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