LLC-OVA 小鼠Lewis肺癌細胞OVA轉染

背景描述

Bertram 等人于 1980 年從 C57BL 小鼠的肺中建立的細胞系，該細胞帶有原發性 Lewis 肺癌的植入所致的腫瘤，被廣泛用作轉移的模型，可用于研究癌癥化學治療劑的機制。抗原表達：H-2b。這些細胞對 1,3-雙-(2-氯乙基)具有抗性，但對甲氨蝶呤敏感。據報道，這些細胞具有高度的致瘤性，但在小鼠中的轉移性較弱。細胞在燒瓶中形成多層，實際上并沒有匯合。測試并發現ectromelia 病毒（鼠痘）呈陰性。

培養條件

準備DMEM培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%+10ug/ml puro。

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

細胞特征

1）來源：國家資源庫

2)  形態：半貼壁生長，混合形態，有上皮細胞樣，松散貼壁或懸浮有梭形、圓形等細胞形態。

凍存條件

無血清凍存液

細胞檢測

不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

供應限制

僅供科研使用

運輸方式

常溫或凍存（T25瓶或者1mL凍存管包裝）

注意事項

如果細胞為穩定轉染的細胞，隨細胞傳代次數的增加，其熒光強度會逐漸減弱。若實驗要求需要維持熒光強度，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選。建議收到細胞后至少傳 3 代，凍存留種后再進行篩選，常規實驗需求不是特別強度高的前 ten代左右無需篩選。初次進行細胞篩選時，建議加入終濃度為 5ug/ml 嘌呤霉素的專用培養基維持培養，若無細胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含 10ug/ml嘌呤霉素的專用培養基繼續篩選，以此類推，至*高藥物濃度為 20ug/ml。若篩選過程中，漂浮細胞大于 60%，則停止篩選，換成正常培養基培養，至細胞密度約 80%，可繼續加入同濃度嘌呤霉素進行篩選。當加入 20ug/ml 嘌呤霉素時細胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥專用培養基正常培養。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3)半貼細胞和貼壁不牢（懸浮）細胞：T25瓶置于37℃培養箱中約2-3h，顯微鏡下觀察細胞的情況，若細胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細胞離心后用專用培養基重懸后打回到原培養瓶中繼續培養，若細胞生長70%-90%對細胞進行傳代，傳代時需要收集培養基中懸浮的細胞離心后回收。

1） 凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL專用培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，專用培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml專用培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

該細胞輕微貼壁和懸浮培養的細胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的專用培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的專用培養基來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。 

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