雙特異性抗體（bispecific antibody,BsAb）是指含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，可以同時與靶細胞和功能細胞進行相互作用，進而增強腫瘤細胞殺傷功能。近年，雙抗迎來研發熱潮，截至2024年底，全球已有19款雙抗藥物獲批上市，在研雙抗藥物數量達數百款。雙抗主要通過基因重組技術進行生產，有多種多樣的分子設計類型，滿足雙抗分子識別兩種不同抗原的能力。
其中IgG-like 的雙特導性抗體在表達中，理論上會伴隨產生10種以上的副產物，主要包括重鏈之間錯配引起的同源抗體（homodimer Fc species）輕鏈與重鏈之間錯配引起的異源抗體（heterodimeric Fc species）結構不完整的片段抗體、如半抗（half antibody）或3/4抗體、以及輕鏈聚集體（light chain dimer）重鏈聚集體（heavy chain dimer）等等。參見示意圖1。
圖1. 雙特異性 mAb 表達中輕重鏈區域的可能組合
科學家們已經找出多種巧妙的分子設計策略來降低上述副產物的產生。其中，經典的要屬降低重鏈同源錯配的 KiH，即 Knob-into-hole 技術，以及降低輕鏈重鏈錯配的 CrossMab 技術。然而，所有分子設計策路都只能盡量降低某類副產物的產生，而不能消除全部的副產物。不僅如此，在雙抗的重組表達過程，還不可避免的會產生不完整的片段抗體以及聚集體。所有這些都給雙抗分子的下游工藝開發提出了挑戰。
面對這個問題，Biozen dSEC2色譜柱嘗試通過對一種lgG-like類型雙抗分子（Vudalimab）進行純度分析，嘗試分離幾類主要的副產物，比如homodimer, half antibody, light chain related impurity aggregate 等[1]。
Vudalimab （分子量約 125.43 kDa）是一種YBODY®平臺工藝生產的二價（1:1）非對稱性的結構; 具體為靶向抗原A的單元Fab-Fc和靶向抗原B的單鏈單元ScFv-Fc 組成 (Fab-ScFv-Fc) （參見圖2）。單元A和單元B在二者Fc-CH3之間通過鹽橋（Salt-Bridge）和“杵入臼"（Knob-into-Hole）等工程改造以有效形成目標雙抗體（heterodimer），并在鉸鏈區（hinge region）形成穩定的鏈間二硫鍵。這些對Fc 的工程改造大大提高了目標雙抗分子的占比，保證了雙抗體生產的高產率以及工藝和產品的穩定性。
圖2. Vudalimab PD-1 × CTLA-4 雙抗示意圖[2]
在Biozen dSEC-2（3um，7.8x300mm） 色譜柱上的分析結果可見：通過和蛋白標準品對比，Vudalimab的洗脫時間略晚于分子量150kDa的human IgG的洗脫時間；放大看Vudalimab的HMWS部分可以看到有至少三種不同分子量分布。推測為Homodimer錯配，目標雙抗聚集體和Homodimer的聚集體等。參見圖3。
圖3. Vudalimab的聚集體和Aqueous SEC check standard的疊圖
Biozen dSEC-2的高親水性改性的硅膠修飾技術結合鈦合金的柱硬件使得和生物大分子的次級作用得到改善，另外，dSEC-2有的孔控制技術也使得這款色譜柱具有柱床穩定，耐壓，批次重現性好的特點。
參考文獻
[1]. Cytiva：雙抗的純化策略
[2]. Mark N. Stein, et, al. A Phase 2 Study of Vudalimab, a PD-1 × CTLA-4 Bispecific Antibody, Plus Chemotherapy or Targeted Therapy in Patients with Molecularly Defined Subtypes of Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer.
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