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技術文章
原代細胞核膜的分離
點擊次數：2473 發布時間：2011-1-24
原代細胞核膜的分離
試劑和器材www.runwelltac.com：
1. DNA酶Ⅰ；
2. KCl（1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl，pH7.4）；
3. MgCl2（1mol/L儲存液）；
4. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（無水乙醇配制的1mol/L儲存液）；
5. 純化的細胞核；
6. 緩沖液：2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
7. 膜懸浮緩沖液（ESB）：0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
8. 梯度溶液：1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
9. 除了MgCl2外的所有溶液須含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟；
10. Abbé折光計；
11. 高速離心機，配有固定角轉子和離心管；
12. 超速離心機，配有固定角和吊桶式轉子、離心管；
13. 相差顯微鏡；
14. 紫外分光光度計（配石英比色皿）；
實驗方法：
除特殊注明外，所有操作均在0—4℃下進行。
1. 將純化的原代細胞細胞核浸于緩沖液中孵育10min使之膨大去凝縮。之后約10000g離心10min，用緩沖液重懸沉淀，并重復這一步驟2次；
2. 用含DNA酶Ⅰ（0.01g/L）的緩沖液重懸凝膠樣溶脹的細胞核沉淀。充分混勻并室溫孵育30min，孵育的中途將上清調節至含約0.1mmol/L MgCl2。隨著DNA被切割裂解，染色質很快失去了凝膠狀特性。可通過相差顯微鏡檢測核膜“影子”的產生；
3. 采用固定角轉子或吊桶式轉子，約60000g離心30min；
4. 用緩沖液重懸核膜粗產物，并再次離心。重復這一步直至DNA釋放為止（即監測上清在280nm下的吸光度，直至達到一很低平臺）；
5. 選擇性地用KCl溶液洗滌獲得地核膜，以加速離子結合蛋白，尤其是組蛋白的去除。然后約60000g離心30min；
6. 將核膜用核膜懸浮緩沖液重懸，覆蓋配制的4個梯度溶液，置于吊桶式離心機中離心若干小時或過夜，以收集核膜等密度層；
7. 純化的核膜應該主要聚集在1.5mol/L與1.8mol/L兩蔗糖層的界面，用巴斯德吸管小心地從梯度液中移出核膜層；
8. 通過相差顯微鏡，或者通過瓊脂糖包埋進行負染和/或薄片電鏡，檢查核膜的完整性；
9. 對純化標本進行必須的生化分析，如SDS-PAGE或是酶學實驗；內源性過氧化物酶是大鼠肝臟核膜的一個合適的標志，同時也存在Mg-ATP酶以及很多內質網酶；www.runwelltac.com
除特殊注明外，所有操作均在0—4℃下進行。
1. 將純化的原代細胞細胞核浸于緩沖液中孵育10min使之膨大去凝縮。之后約10000g離心10min，用緩沖液重懸沉淀，并重復這一步驟2次；
2. 用含DNA酶Ⅰ（0.01g/L）的緩沖液重懸凝膠樣溶脹的細胞核沉淀。充分混勻并室溫孵育30min，孵育的中途將上清調節至含約0.1mmol/L MgCl2。隨著DNA被切割裂解，染色質很快失去了凝膠狀特性。可通過相差顯微鏡檢測核膜“影子”的產生；
3. 采用固定角轉子或吊桶式轉子，約60000g離心30min；
4. 用緩沖液重懸核膜粗產物，并再次離心。重復這一步直至DNA釋放為止（即監測上清在280nm下的吸光度，直至達到一很低平臺）；
5. 選擇性地用KCl溶液洗滌獲得地核膜，以加速離子結合蛋白，尤其是組蛋白的去除。然后約60000g離心30min；
6. 將核膜用核膜懸浮緩沖液重懸，覆蓋配制的4個梯度溶液，置于吊桶式離心機中離心若干小時或過夜，以收集核膜等密度層；
7. 純化的核膜應該主要聚集在1.5mol/L與1.8mol/L兩蔗糖層的界面，用巴斯德吸管小心地從梯度液中移出核膜層；
8. 通過相差顯微鏡，或者通過瓊脂糖包埋進行負染和/或薄片電鏡，檢查核膜的完整性；
9. 對純化標本進行必須的生化分析，如SDS-PAGE或是酶學實驗；內源性過氧化物酶是大鼠肝臟核膜的一個合適的標志，同時也存在Mg-ATP酶以及很多內質網酶；www.runwelltac.com