ELISA測定現通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、大鼠ELISA試劑盒洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。
盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結于下表。ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因問題可能的原因（非試劑盒本身的原因）
1．弱陽性質控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題
2．大鼠ELISA試劑盒測定的重復性差 （相同樣本兩次測定結果不一致） 這是典型的由測定操作引起的問題，包括
（1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致；（2）加樣過快，孔間發生污染；