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凝膠電泳常見問題分析

閱讀:2530      發(fā)布時間:2015-4-23
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要跑瓊脂糖凝膠電泳, 5ng 就能很清楚的跑出來是這樣嗎?能夠照相的清楚的條帶,至少需要多少量呢?
參考見解:5ng 已經(jīng)可以了,但是或許20ng50ng-200ng效果好,在此范圍內(nèi)呈線性。

把210bp的pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切,得到190+20bp的兩個片段,請問能用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果嗎?用多大濃度的膠和多大的電壓呢?
參考見解:可以用瓊脂糖凝膠電泳分開,電壓不變,可用1.5%到2%的膠,20bp得片斷不一定能看得到,所以應(yīng)用未酶切的PCR片斷作對照.


瓊脂糖濃度(W/V)



大小范圍(bp)



0.6%



1000-23000



0.8%



800-10000



1.0%



400-8000



1.2%



300-7000



1.5%



200-4000



2%



100-3000



丙烯酰胺凝膠電泳更適合于分離純化小分子量核酸(5-500bp)并且分辨率高,可以達(dá)到1個bp。所以建議進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳試試。

Marker做瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)Marker在加樣孔有一個明顯的亮帶,什么原因?
參考見解:marker有時會出現(xiàn)這樣的問題,應(yīng)該是時間久了。新買時跑膠在點樣孔沒有,過一段時間就會在點樣孔出現(xiàn)亮點。也可能是蛋白,有時DNA提的不純含有蛋白時就會出現(xiàn)上樣孔有條帶的現(xiàn)象。

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA時,跑出的帶后面出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,什么原因造成的?
參考見解: DNA帶模糊??:
1、 DNA降解??避免核酸酶污染。
2、 DNA上樣量過多??減少凝膠中DNA上樣量。
3、 所用電泳條件不合適??電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm,溫度<30℃,巨大DNA鏈,溫度應(yīng)<15℃,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
4、 DNA樣含鹽過高??電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。
5、 有蛋白污染??電泳前酚抽提去除蛋白。
6、 DNA變性,?電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

將從組織提取的DNA進(jìn)瓊行脂糖凝膠電泳,用的1.5%的膠加了EB,80V跑1小時,溴酚藍(lán)已經(jīng)跑到頭了,在紫外燈觀察什么帶也沒有,只見孔里面有橘紅色的亮光。好象沒跑出來,是怎么回事?

參考見解:
1、 根據(jù)目的條帶長度來調(diào)整凝膠濃度,一般1.5%左右,也不一定。
2、 紫外燈下沒見帶,不一定沒有出孔,而是量少看不到,可以測一下濃度看一下,或直接試跑一下PCR。
3、 加一個marker孔,尤其你*次跑膠時。
4、 電泳時間可能過長,一般75v×30min左右,但是具體看溴酚藍(lán)的離孔距離和目的條帶離孔距離。

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