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結(jié)核分枝桿菌分子菌種鑒
閱讀：2944 發(fā)布時(shí)間：2010-12-3①PCR菌種鑒定法。用各種分枝桿菌特異性引物對(duì)標(biāo)本DNA進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增或多重PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定；或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴(kuò)增，然后再用菌種特異的內(nèi)部引物進(jìn)行巢氏擴(kuò)增鑒定。該法靈敏、快速，但目前能夠鑒定的菌種尚不多，主要有MT、牛分枝桿菌、MT復(fù)合群、鳥(niǎo)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌。
②PCR-直接測(cè)序鑒定法。用分枝桿菌屬特異的引物對(duì)標(biāo)本的16SrRNA或65ku抗原基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后直接測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，比較其核苷酸的差異來(lái)鑒定菌種。但該方法無(wú)法鑒別少數(shù)分枝桿菌，而且技術(shù)要求高，需昂貴的特殊儀器，而難以推廣。
③PCR-DNA探針鑒定法：用分枝桿菌屬特異的引物對(duì)標(biāo)本中分枝桿菌16S或16S一23SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后與各種分枝桿菌特異的寡核苷酸探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交或微孔板反向雜交鑒定菌種。該法較靈敏、快速，但目前只能鑒定部分菌種。
④PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）鑒定法。PCR-RFLP菌種鑒定法是以分枝桿菌屬特異性引物對(duì)標(biāo)本中分枝桿菌6Sku蛋白編碼基因、16S或16-23SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后用不同的限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增片段，通過(guò)電泳分析酶切圖譜來(lái)鑒定菌種。目前只能鑒定部分菌種，重復(fù)性還不夠理想。
祖燕、張國(guó)龍等以DR為基礎(chǔ)的Spoligo typing DNA指紋方法參照“SPOLIGO TYPlNG”一書(shū)。合成43種特異的DR間隔區(qū)短核苷酸序列，并將它們依次按順序固化于Bio-dyneC膜（PallBiosupport公司）上，一般按膜大小固化數(shù)十排，以便可以同時(shí)完成多個(gè)臨床標(biāo)本的Spoligotyping鑒定工作。然后用新鮮配制的16％的EDAC（Sigma公司）溶液激活固化好的生物膜，將生物膜裝置于Miniblotter MN45中待用。
PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因組DNA上的重復(fù)元件DR之間的序列，引物為
DRa：5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’
DRb：5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’
且DRa 5’末端標(biāo)記有生物素。將PCR產(chǎn)物置于固定在MiniblotterMN45中的BiodyneC膜上，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒使之雜交、顯色，結(jié)果即為結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping的DNA指紋圖譜。
⑤PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（PCR SSCP）初步菌種鑒定法。PCR-SSCP技術(shù)是目前zui廣泛應(yīng)用的一種根據(jù)單鏈DNA構(gòu)象差別快速、靈敏地檢測(cè)基因變異的方法。由于16SrRNA 123～275位核苷酸是分枝桿菌屬高度變異的區(qū)域，不同種分枝桿菌DNA單鏈的空間構(gòu)象不同，電泳后片段的遷移率也就不同，從而呈現(xiàn)出不同的圖譜，zui終建立了新的PCR-SSCP分枝桿菌分子菌種鑒定方法。應(yīng)用該方法能夠鑒別MT復(fù)合群和NTM，NTM菌種之間的鑒別尚在研究之中。
⑥PCR-基因芯片鑒定法。基因芯片技術(shù)是指將大量核酸分子以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在載體上，檢測(cè)帶標(biāo)記的待測(cè)樣品DNA，是一種大規(guī)模分析遺傳差異的新方法。目前少數(shù)實(shí)驗(yàn)室利用分枝桿菌16S rRNA或rpoB基因某些位置上的分枝桿菌屬或種特異的核苷酸變化，研究通過(guò)雜交測(cè)序鑒定分枝桿菌菌種。