化工儀器網
技術文章
染色質免疫沉淀分析（ChIP）
閱讀：972 發布時間：2011-6-15染色質免疫沉淀分析（ChIP）
點擊次數：359 發布時間：2009-9-22
ChIP是目前確定與特定蛋白結合的基因組區域或確定與特定基因組區域結合的蛋白質的方法（圖2—8），也可用于分析與轉錄、有絲分裂或DNA損傷相關的發生改變的組蛋白修飾。ChIP技術和芯片技術的結合有利于確定全基因組范圍內染色體蛋白的分布模式以及組蛋白修飾情況。該技術主要應用于：①組蛋白修飾研究；②轉錄調控分析；③藥物開發研究；④有絲分裂研究；⑤DNA損失與凋亡分析。ChIP是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。
1．DNA剪切條件的優化
建立打斷交聯的DNA長度為200—1 000bp的實驗條件。改變超聲時電壓設置，確保操作時，樣品一直放在冰上，因為超聲產生的熱量會使DNA變性，通過電泳檢測恢復交聯后的超聲DNA片段。
2．實驗步驟
可采用Upstate公司的Chromatinlmmunoprecipitation（ChIPs）AssayKit進行操作。注意：步驟（3）～（7）應該置于冰浴中操作。
（1）處理10C1TI培養皿上1X10‘細胞，確保目的基因處于轉錄激活狀態，同樣處理另一個10cm培養皿用于細胞計數。
（2）將組蛋白與DNA相互交聯，加入終濃度為1％甲醛到培養基上，37℃孵育10min。
（3）盡可能的吸去培養液，用含有蛋白酶抑制劑的冷PBS洗兩次。
（4）將細胞刮人錐形管中。
（5）4℃，2 000r／min離心4min。將SDS裂解液放置室溫，使SDS溶解，并加入蛋白酶抑制劑。
（6）將細胞沉淀加入200／llSDS裂解液，冰上孵育10min（200／ul SDS裂解液是對于1X106細胞，如果有更多的細胞，要相應增加SDS裂解液的用量）。
（7）將DNA用超聲打斷，DNA片段長度為200—1 000bp，應在冰浴中操作，同通過優化超聲的條件，使DNA片段長度保持在200—1 000bp之間。
（8）加人8u1 5mol／LNaCl，65℃，4h，解交聯。
（9）通過酚—氯仿提取DNA，并用含有溴化乙啶的2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察超聲打斷DNA的效率。
3．染色質免疫沉淀分析
如果超聲條件通過上述實驗得到優化，可以在完成上述（1）一（7）步后，進行下面的實驗。對于陰性對照，可以采用非抗體免疫沉淀對照，另外也要采用非激活的樣品作為PCR部分的對照。
（1）將所得樣品4C，13 000 r／rain離心10 min，加入200／11超聲過的細胞上清液到2ml的離心管中，棄掉沉淀。
（2）將超聲過的細胞上清液用10倍的ChIP稀釋緩沖液稀釋。
（3）為了減少非特異性背景，在2ml的細胞上清液中加入80ul魚精DNA／50％蛋白A瓊脂糖混合物，在4~C震蕩30min，增加孵育時間，可以進一步減少非特異性結合。
（4）通過短暫離心，沉淀瓊脂糖，并收集上清液部分。
（5）加入免疫沉淀的抗體到2ml的上清液部分，在4~C震蕩孵育過夜。對于陰性對照，在上清液中加入60ul魚精DNA／50％蛋白A瓊脂糖混合物，4~C震蕩1h，繼續上述（7）步驟。
（6）加入60ul魚精DNA／50％蛋白A瓊脂糖混合物，4~C震蕩1h，以結合抗體／組蛋白復合物。
（7）輕微離心沉淀瓊脂糖（700—1 000r／min，4~C，1min），棄掉含有未結合的非特異性DNA，用下面的液體1m1在翻轉板上依次洗蛋白A瓊脂糖／抗體／組蛋白復合物3～5rain。
經過上述處理后的樣品為蛋白A瓊脂糖／抗體／組蛋白復合物，可以用于免疫共沉淀／免疫印跡或PCR分析。
[ 打印 ] [ 返回頂部 ] [ 關閉 ]