化工儀器網
公司動態
利用血清篩選噬菌體文庫
閱讀：584 發布時間：2011-8-10利用含有目標受體的復雜混合物，對噬菌體展示肽文庫進行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細胞或組織表面等。在此情況下，目標就是要鑒定出結合于特定受體分子或結合于一組具有特定性質的受體上的多肽。
我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關抗體的相應配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來自HCV感染者和非感染者的血清（以下分別稱為陽性血清和陰性血清）進行噬菌體展示文庫篩選。該實驗方案涵蓋了從構建噬菌體文庫到鑒定HCV特異性抗體配體的全部實驗步驟。本章所提及的大部分思路和實驗方案同樣適用于其他復雜的受體體系。
隨機肽文庫
目前主要有兩種利用絲狀噬菌體的噬菌體展示系統，均已被開發并廣泛應用超過15年。外源肽段是以N端融合到次要（pⅢ）或主要衣殼蛋白（pⅧ）的形式進行表達的。區分這兩種表達系統的特征是其每個噬菌體顆粒所展示的拷貝數目：在基于pⅢ的系統中，每個噬菌體展示拷貝數可從少于1個至多達5個；而基于pⅧ的系統中，每個噬菌體衣殼上卻可以展示數十到數百個多肽。后一種特性業已證明在用血清篩選，尤其是對隨機肽文庫篩選時，具有更顯著的優勢。實際上，噬菌體表面上多肽的高拷貝展示，增加了噬菌體-抗體相互作用的親和性，從而即使不是全部，也可以選擇到血清樣本中的大多數抗體。通過在體外將合成的隨機序列克隆到展示載體上來構建文庫，而后連接產物轉化到細菌中。以前這zui后一步的效率將噬菌體文庫復雜度限制在包含不超過108個不同序列以內。因此，隨機肽文庫通常只包含了所有可能序列的很少部分。我們已試圖通過增加肽文庫的有效復雜度來改進這種狀況。用一種密碼子為基礎的方法合成隨機序列，即每一位點僅有20個用于編碼20個不同氨基酸的三聯體密碼子，如此就消除了密碼子的簡并性并剔除了終止密碼子。
天然表位文庫
在傳染性因子已知并可得到其基因組的情況下，一種鑒定DS-Ab配體的誘人方法是構建一個噬菌體展示互補DNA（cDNA）文庫，然后用來自病人的血清篩選。這種方法有明顯優勢，這是因為天然表位序列可優先涵蓋于噬菌體文庫中。然而，必須記得，在整合到噬菌體顆粒之前，融合在pⅢ或者pⅧ上的配體要先移行通過大腸桿菌的分泌胞器并轉運到外周質腔中折疊。妨礙融合肽的正確加工和（或）折疊過程，可能會極大地影響這些噬菌體文庫的有效復雜度。
在天然表位文庫中，特別對于那些構象表位，外源肽的大小可能比噬菌體表面所能展示的拷貝數更加重要。這就是為什么pⅢ或pXⅢ均會被采用的原因。在此，我們描述一個噬菌體文庫的構建，來自HCV基因組的序列將被展示在噬菌體表面上。