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用scFv接頭PCR裝配VH和VL進行scFv基因文庫的構建
閱讀：857 發布時間：2010-7-21器材和試劑]
● PCR試劑和設備
● Geneclear試劑盒（Qbiogene，Inc．）
● V區特異性正向（JΚFOR和JΛFOR）和反向（VuBACK）PCR引物
● scFv接頭DNA
[方法]
1．在0．5ml微量離心管內配制以下PCR反應混合液。配制成2個“反應管”，1個含有 V。文庫DNA，另1個則含有Vl文庫DNA。
反應管 對照1 對照2
● scFV接頭DNA（100ng/ul） 1．0ul 1．0ul
● VH文庫DNA（100ng/ul） 3．5ul 1．0ul
● V-文庫DNA（Vκ或Vλ）（100ng/ul） 3．0ul 1．0ul
● 水 6．5ul 5．5ul
2．在每管中加入：
● 水，33ul
● 10×Vent緩沖液，5．0ul
● 20×dNTP， 2．5ul
3．在熱循環儀格內加熱反應管到94℃，5分鐘。如果沒有加熱蓋，則滴加1滴輕質礦物油覆蓋反應液（Sigma）。
4．加入2．Ogl Vent DNA聚合酶。
5．以94℃1分鐘、65℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環7次，隨機地連接片段。
6．7次循環后，保持94℃；每套旁側引物各加入lul（等物質的量的6種VHBACK引物的混合物、等物質的量的5種JκFOR或JλFOR引物的混合物，使每種引物混合液zui終總濃度達到10pmol/ul）。
7．以94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘、72℃ 1分鐘，共25個循環擴增片段。
8．取3ul PCR反應物， 以確定剪接是否成功。已裝配好的scFv長度應為0．8～0．9kb，而且在陰性對照反應中沒有相同大小的產物。
9．用1．0％瓊脂糖凝膠電泳純化已裝配好的基因文庫，再用Geneclean提取。將每種產物重懸于20ul水中。在1％瓊脂糖凝膠中，與已知大小和濃度的標準對照品比較，測定DNA濃度。為構建抗體文庫，已剪接的scFv基因文庫接著必須進行再擴增，添加上限制性位點以便能克隆到噬菌粒載體中