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單克隆與器官或組織的脈管系統特異性結合的建立
閱讀：858 發布時間：2010-8-4在篩選和測序后，下一步是將單克隆的結合性用以下三種形式顯示出來：首先，得自靶標器官的、相對于無插入序列的噬菌體及其他器官和組織而數量增加的噬菌體；其次，在器官或組織的脈管系統上進行免疫組化和免疫熒光染色時的陽性染色；第三，我們合成、注射以及分析熒光標記的同源多肽的生物分布，以此來建立多肽在噬菌體環境之外的活性。
1 體內和體外的結合性
根據實驗方案10．2可以快速檢測幾個單克隆在體外的結合性，接下來根據可以檢測單克隆在體內的結合性。陽性克隆具有得自靶標器官的、相對于無插入序列的噬菌體及其他器官、組織和細胞數量增加的噬菌體；可能在對照器官和組織中具有比在無插入序列的噬菌體中更低的本底；而且常常比噬菌體源群落表現得更好。
對于一個單克隆，體外結合與體內定位之間的比較也能提供一些關于其受體分布的信息。例如，在體內篩選中發現了定位于肺的GFE—1多肽，并發現與其他器官和組織比較時，它僅定位于體內的肺脈管系統。然而，當進行體外試驗時，該多肽與肺和腎的原代細胞制備液都能結合。在發現了此多肽的受體——膜二肽酶以后，該原因變得清晰：膜二肽酶不僅在肺脈管系統中被發現，而且在肺和腎的實質細胞（parenchymal cell）中也都存在；它具有一個能將體內數據和體外數據正確起來的分布。
2 免疫組化和免疫熒光
比起在前面實驗方案中采用的感染性檢測，免疫組化和免疫熒光的靈敏度較低，因此在我們的實驗方案中，有可能陽性脈管系統有染色，而在陰性對照器官中的本底則未著色。
對于篩選中的免疫組化和免疫熒光，我們進行了同樣的對照比較：噬菌體比噬菌體和靶標比靶標。在多種器官和組織中尋找無插入序列的噬菌體的存在時將產生一組數據。、肝臟既是噬菌體免疫組化的陽性對照也是其陰性對照，因為Kupffer細胞（巨噬細胞）的著色是強陽性的；然而，脈管系統是陰性的。Kupffer細胞著色的原因是通過這些細胞從循環中消除了噬菌體。
對于針對fd和T7多克隆血清的組織學程序的陰性對照，應該包括純化的兔血清，或用不相關的抗原對動物進行類似免疫而得到的IgG。把這些以相同的濃度用作初級抗體。
3 結合的特異性
在用噬菌體計數、免疫組化和免疫熒光進行觀測時，那些合成的同源多肽可能減少或消除對靶標的結合，我們通過這一點的顯示確定特異性。一般將一個結合性或定位性的多肽轉入單價的T7 Selecg—1載體或使用單獨的T7 Select415-1克隆，并從lmg/m1的多肽溶液開始（大約lmmol/L）繪制抑制曲線，然后以半對數增量（half-1og increment）+0．01tumol/L逐步增加。如果使用的是單價展示多肽，那么從抑制曲線測定的IC50就是多肽的表觀Kd值。