液相色譜的分離本質基于溶質在流動相與固定相間的動態分配平衡，二者的協同作用直接決定分離度（Resolution）、峰形對稱性（Tailing Factor）和檢測靈敏度（Sensitivity）。
1. 固定相類型與特性
反相色譜柱（RPLC）：以C18（ODS）、C8、苯基柱為代表，固定相表面鍵合非極性烷基鏈，適用于80%以上的有機小分子分析。
應用場景：藥物代謝物、多環芳烴、脂肪酸等中等至低極性化合物。
技術進展：核殼色譜柱（如Kinetex®）通過核-殼結構設計提升柱效（>100,000 plates/m），兼顧高分離速度與低背壓。
正相色譜柱（NPLC）：硅膠、氰基柱（CN）、氨基柱（NH2）為主，依賴極性相互作用，適用于異構體、脂溶性維生素等強極性物質分離。
離子交換色譜（IEX）：通過帶電官能團（如磺酸基、季銨基）分離生物大分子（蛋白質、核酸）。
2. 關鍵選擇參數
粒徑（Particle Size）：
常規分析柱：3-5 μm，平衡分離效率與操作壓力。
UHPLC專用：1.7-2.7 μm，需匹配超高壓系統（>600 bar）。
孔徑（Pore Size）：
小分子（MW <2000 Da）：80-120 ? 孔徑。
生物大分子：300 ? 以上以減小傳質阻力。
封端處理（Endcapping）：采用短鏈硅烷封閉殘余硅羥基，減少堿性化合物拖尾（如三乙胺封端技術）。
3. 方法開發案例
藥物雜質分析：選用耐酸性的C18柱（如Agilent ZORBAX SB-C18），在pH 2.5條件下穩定分離降解產物。
手性分離：纖維素衍生物固定相（Chiralcel OD-H）通過π-π作用拆分對映體。
1. 溶劑體系設計
反相色譜典型組合：
弱洗脫劑：水（添加0.1%甲酸增強離子化）
強洗脫劑：乙腈（低粘度、高洗脫強度）或甲醇（成本低，兼容性強）
梯度優化：通過線性梯度（如5%-95%乙腈/20 min）平衡分離速度與峰容量。
2. pH值與緩沖液選擇
酸性條件（pH 2.5-3.5）：抑制硅膠溶解，適用于含硅烷基固定相。
緩沖鹽推薦：10 mM磷酸二氫鉀（pKa 2.1）、甲酸-甲銨體系。
中性至堿性條件（pH 7-9）：需使用耐堿色譜柱（如Waters XBridge Shield RP18）。
風險控制：避免使用碳酸鹽緩沖液（易析出結晶損壞系統）。
3. 添加劑增效技術
離子對試劑：添加庚烷磺酸鈉（針對堿性化合物）或四丁基溴化銨（酸性化合物），改善峰形。
柱溫調控：升高溫度（30-50℃）可降低流動相粘度，提升柱效，但需評估熱敏感化合物穩定性。
1. 系統適用性測試（SST）
驗證指標：理論塔板數（N >2000）、拖尾因子（0.9-1.5）、重復性（RSD <2%）。
2. 常見問題與解決方案
峰分叉：檢查色譜柱入口篩板堵塞或固定相塌陷，可反向沖洗再生。
保留時間漂移：確認流動相pH穩定性，避免碳酸鹽緩沖液CO2揮發導致pH升高。
綠色色譜：采用乙醇、丙二醇等生物基溶劑替代乙腈，降低環境毒性。
多維色譜聯用：結合HILIC/RPLC二維分離，提升復雜樣本解析度。
液相色譜方法開發需遵循“固定相-流動相-操作參數"的系統優化路徑。通過精準匹配固定相特性與化合物性質，結合智能梯度設計和先進添加劑技術，可顯著提升分析效能。未來，隨著新型固定相材料與綠色溶劑的創新，液相色譜將在精準醫療和環境痕量檢測中發揮更大價值。
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