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螢火蟲(Photinus pyralis)熒光素酶已被證實是檢測啟動子活性和監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控狀態(tài)的理想的報告基因。它是在細胞質(zhì)中作用的酶，分子量61kDa并催化下列反應(yīng)：
 

以前，應(yīng)用螢火蟲熒光素酶檢測遺傳因子上調(diào)是比較容易的。但是由于檢測量綱對基因的下調(diào)表達定量過于狹窄，而且例如細胞死亡等非特異因素能降低熒光素酶，它并不是很適合于研究基因表達的下調(diào)。因此，通過以單個參比報告基因為標準均一化實驗中所用的報告基因就成為區(qū)分特異和非特異細胞應(yīng)答效果影響的有效方法。均一化方法同樣是協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)染效率差異和細胞活力差異的有效方法。

用亮度計或熒光讀取儀可以發(fā)現(xiàn)：發(fā)出熒光的光強和熒光素酶的數(shù)量成正比例關(guān)系。以前，應(yīng)用螢火蟲熒光素酶檢測遺傳因子上調(diào)是比較容易的。但是由于檢測量綱對基因的下調(diào)表達定量過于狹窄，而且例如細胞死亡等非特異因素能降低熒光素酶，它并不是很適合于研究基因表達的下調(diào)。因此，通過以單個參比報告基因為標準均一化實驗中所用的報告基因就成為區(qū)分特異和非特異細胞應(yīng)答效果影響的有效方法。均一化方法同樣是協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)染效率差異和細胞活力差異的有效方法。

螢火蟲和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報告并進行均一化研究。由于它們都是快速，容易和高靈敏的監(jiān)測方法。而且螢火蟲和海腎熒光素酶是理想的雙基因報告系統(tǒng)，因為它們來源于不同的生物進化方向，蛋白結(jié)構(gòu)和底物差異都很大，在實驗中不會產(chǎn)生相互影響。

GeneCopoeia充分利用了螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶結(jié)構(gòu)和底物的不同，優(yōu)化并開發(fā)了方便的檢測體系可以方便連續(xù)地定量測定兩種熒光素酶的活性。兩種酶酶活活性的檢測可以依次在同一樣品里檢測出。螢火蟲熒光素酶的熒光可以被一種試劑激發(fā)，并且第二種試劑可同時淬滅螢火蟲熒光素酶的熒光和激發(fā)海腎熒光素酶酶的熒光。

GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Kit開發(fā)團隊給該產(chǎn)品帶來了幾點優(yōu)勢和特點，可以增強產(chǎn)品的性能和增加產(chǎn)品的方便性。使用者可以充分感覺到以下幾點優(yōu)勢：

1. 該系統(tǒng)已在好幾種不同的哺乳動物細胞中測試，經(jīng)過優(yōu)化處理可適合高通量監(jiān)測儀器的micro-plate探頭，單孔樣品同樣可以被監(jiān)測。
    
2. 該系統(tǒng)只能產(chǎn)生非常微弱的背景熒光(圖1)。從讀取數(shù)值可知：沒有差異值是必需的。

   圖表 1 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay的熒火蟲熒光素酶具有低背景的特點

3. 工作溶液I (溶液I中含有底物I)還有所有和裂解細胞有關(guān)的組分，并添加了可在同一反應(yīng)液中與螢火蟲熒光素酶反應(yīng)的底物和穩(wěn)定劑。
4. 海腎熒光素酶緩沖液含有淬滅螢火蟲熒光素酶活性的成分。(圖2)
   

   圖表 2 加入溶液II后，螢火蟲熒光素酶的活性被淬滅。在6孔板中培養(yǎng)HEK293細胞培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染pEZX-MT01 質(zhì)粒(miRNA的熒光素酶報告質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時，檢測激發(fā)熒光。根據(jù)實驗步驟，96孔板的酶活依次被檢測。檢測完成后，只加溶液II(沒有底物II)到右邊半板的孔中。整塊板在Victor II機器上再次讀取熒光，大約95%的螢火蟲熒光素酶的熒光被淬滅。

   
   
    
5. 試劑經(jīng)過多次優(yōu)化改進后，可以使得螢火蟲和海腎熒光素酶的信號相對穩(wěn)定(圖3)。22°C加入適當試劑后30分鐘，螢火蟲熒光素酶的活性才只有原來的80%，而海腎熒光素酶的活性15分鐘后才為原來的80%。
   

   圖表 3 GeneCopoeia Luc-Pair miR Luciferase Assay螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的信號的穩(wěn)定性。在6孔板中培養(yǎng)HEK293細胞培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染pEZX-MT01 質(zhì)粒(miRNA的熒光素酶報告質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時，檢測激發(fā)熒光。根據(jù)實驗步驟，96孔板的酶活依次被檢測。某A 公司的雙熒光報告系統(tǒng)檢測試劑盒用作參比。圖3a：螢火蟲熒光素酶的酶活信號；圖3b海腎熒光素酶的酶活信號。

   
   
   
   
   

    

6. 該系統(tǒng)被設(shè)計和優(yōu)化出在多個數(shù)量級別范圍內(nèi)穩(wěn)定可信的熒光值和質(zhì)粒濃度間穩(wěn)定的線性結(jié)果。

   (a)	(b)

   圖4 檢測到的激發(fā)熒光(熒光酶酶活的度量)和轉(zhuǎn)化到HEK293 細胞中熒光素酶 質(zhì)量的線性關(guān)系。 HEK293細胞在6孔板中培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染不同質(zhì)量梯度(如圖所示)的GeneCopoeia pMRO or pEZX-MT01 質(zhì)粒(miRNA的熒光素酶報告質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時，檢測激發(fā)熒光。如圖所示：通過pMRO質(zhì)粒檢測螢火蟲熒光素酶的酶活(圖：4a)；通過pEZX-MT01質(zhì)粒檢測海腎熒光素酶的酶活(圖：4b)。

   
   
7. 可檢測3' UTR靶標克隆上靶標受到特定miRNA的抑制效應(yīng)(圖：5)。HEK293細胞在6孔板中培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)染1.0 mg的 3' UTR表達克隆 (pEZX-MT01-Lin28 UTR-fLuc)和 1.4 mg的miRNA 表達克隆(或 miRNA 參照質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染18小時后，把HEK293細胞移到96孔板中培養(yǎng)24小時。通過Victor II儀器定量檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶酶活。螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶酶活以海腎螢光素酶酶活為基準進行均一化。
    

   圖表 6 在293T細胞里foskolin誘導的依賴CRE的熒光素酶表達

8. 在293T細胞里foskolin誘導的依賴CRE的熒光素酶表達(圖：6)。 螢火蟲熒光素酶基因可以被CRE元件控制(cAMP應(yīng)答控件)，該基因被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到293細胞系后，細胞在96孔板里培養(yǎng)一天后，體系用不同濃度的foskolin(FSK，乙酰環(huán)化酶激活子)再處理16個小時。通過Victor II儀器定量檢測螢火蟲螢光素酶。(該實驗不涉及海腎熒光素酶的酶活)