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 原因

解決方法

一抗與膜的孵育時間不夠

磷酸化蛋白抗體是針對于特定的一個或兩個磷酸化位點的，特異性很高但往往比常規的抗體能得到的信號要弱一些。用合適的緩沖液稀釋，并在4°C與膜孵育過一夜，對于磷酸化抗體來說很關鍵。

電泳后的蛋白沒有全部轉移到膜上

增加轉膜所用的時間或電壓。通過預染分子量標準品判斷轉膜是否*，不建議用染料染膜來觀察，因為這樣會抑制化學發光反應。

膜的封閉時間過長

在牛奶中封閉時間太長會遮蔽抗原表位并會把轉移到膜上的蛋白置換下來。封閉只需1小時（決不要過一夜封閉）。

目的基因的表達量太少，低于檢測底限。

每條泳道中上樣總蛋白20 μg通常就足夠了。如果目的基因的表達水平較低，則可以增加上樣量。或是在做SDS-PAGE之前先做免疫沉淀。嘗試其他細胞系或是高表達該蛋白的組織樣品。

二抗太弱。

換用其他批次的二抗或是提高二抗的濃度。

LumiGLO^?試劑沒有按規定配制或是儲存液試劑A和B已經相互污染。

重新配制LumiGLO^?試劑。用抗生物素-HRP和生物素標記的分子量標準品作為化學發光檢測反應的陽性對照。