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Nanodrop One與Qubit 4的區別
凡是需要做分子生物學實驗的lab，肯定逃不了要買一臺核酸定量的機器。目前流行的儀器是Nanodrop One，只需滴加一兩微升的樣品，按一下按鈕，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到濃度數據。近幾年，以Qubit 4為代表的基于特異熒光染料法的儀器也逐漸進入科研人員的視野。那么，這兩類儀器有什么區別，在使用時需要注意什么，如何根據實驗室需求來選購？且聽老司機分解。
首先我們需要來理解兩臺儀器在核酸定量原理上的區別。正如方才所言，Nanodrop One利用了核酸的紫外吸收特性。
（圖1：Nanodrop One）
核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構成。其中，由于堿基含有芳香環結構，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特征吸收波長為260 nm。根據朗伯比爾定律，已知物質的消光系數（幾十年前早已測量），液層的厚度（固定的樣品室），就能利用其吸光度來計算出物質的濃度。與此同時，還能通過計算A260/A280和A260/A230的數值，估計核酸的純度。（280 nm吸光通常來自蛋白質，而230 nm則通常來自糖類和苯酚等。）
而Qubit 4這一類儀器采用的是熒光染料法。這些熒光染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結合，并在特定波長光源的激發下，發出熒光。其中，結合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號可增幅數十倍至數百倍，因此可以和背景區分開來。目前，做測序的實驗室基本把Qubit 4當標配儀器了。
（圖2：Qubit 4.0）
雖然以Nanodrop One為代表的紫外吸收法在科研領域已經沿用了數十年，但由于原理上的限制，這一類儀器有無法避免的缺陷。
1、紫外吸收法無法區分DNA和RNA
這一點其實在原理上就很好理解了。如下圖所示，具有紫外吸收的結構是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當一份樣品同時含有DNA和RNA的時候，無論你本意是想測哪一個，均會高估其真實濃度。
（圖3：核酸的結構）
而Qubit 4的熒光染料法則避免了這個問題。只要采用DNA、RNA特異的染料，就能有選擇性地測定樣品中的核酸濃度。下圖是Qubit 4的*測試數據。這個實驗是在DNA樣品中混合入不同比例的RNA，并用Qubit 法和紫外吸收法分別進行測定。當DNA的樣品足夠純時（DNA：RNA = 10：0），兩種方法測得的數值并沒有顯著區別。但當混入的RNA越來越多，紫外吸收的數值也跟著升高（藍色和綠色柱子），而使用雙鏈DNA染料的Qubit數值則沒有改變（紅色柱子）。使用RNA染料用Qubit 4進行測定，則會發現，隨著RNA混入的增加，讀數也跟著升高。
（圖4：Qubit和紫外吸收法對DNA-RNA混合樣品的測定）
目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質均有特異的熒光染料。也就是說，無需專門純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。
2、紫外吸收法的定量限較高
記得有一次做實驗，放了0.5 µg質粒做酶切，跑膠回收于30 µl的溶液中，然后做Nanodrop測定濃度，后數值約為25 ng/µl……
于是本司機得到的結論是：我們實驗室的那臺Nanodrop一定是內置了賢者之石（霧——） 還是去隔壁借用一下Qubit吧。
其實是這樣的，對于任何儀器分析，我們都應該去理解其檢出限和定量限。Nanodrop標稱的檢出限是2 ng/µl（雙鏈DNA），然而定量限則遠高于此。其他的Nanodrop one用戶也有類似的體驗，曾經在ResearchGate上看到說，低于50 ng/µl的話就容易測不準，變異度會增大。以下同樣是來自Qubit的*數據。當DNA的濃度低于某個程度時，紫外吸收法的偏差和變異度就突破天際了。
（圖5：Qubit與紫外吸收法測定低濃度DNA時的偏差及變異度比較）
這兩張圖中，紫外吸收法得到的偏差和變異度在我看來已經算小的了（不能搞太大啊，不然沒人買怎么辦？數據來自Thermo Fisher公司，但他們家兩類儀器都有，手心手背都是肉），要低于4 ng/µl雙鏈DNA才會亂飆車。然而在實際使用中，低于10甚至20 ng/µl時就比較容易出亂子。而PCR產物膠回收等應用，終的實際濃度往往就落在這個容易測不準的范圍內。雖然這對老司機們來說還不至于把下游實驗搞砸，但測不準還是很郁悶的。
3、紫外吸收法對溶液的pH和鹽濃度敏感
在研究物質吸光度時，我們總要明確地定義緩沖液的離子強度以及pH，這就說明，吸光度本身是受到這兩個因素影響的。
通常而言，偏酸的溶液，容易給出偏低的A260/A280數值。相反，偏堿的溶液則容易高估。相應地，也有報道稱，當用水作為溶劑時，紫外吸收測定的數值變異度增大，而當使用Tris或Tris-EDTA溶液進行測定時，重復性就提高了。這其中的原因，很可能是空氣中溶解入水中的CO2濃度差異造成的。離子強度對于紫外吸收的影響比較復雜，這里不展開。
相比之下，熒光染料法對樣品的污染和pH等的容忍度較大。
4、紫外吸收法對降解比較嚴重的核酸無能為力
這一點，同樣也是由紫外吸收原理的局限性所決定的。紫外吸收測定的對象是堿基，因此無論核酸是完整成鏈的，還是降解成單個游離核苷酸，該方法均無法加以區分。盡管我們可以通過A260/A280數值是否過大來估計核酸樣品的降解狀況，但卻無法選擇性地只測定那些結構完整的核酸的濃度。
而熒光染料通常結合的是核酸的鏈結構，并不會與游離的單核苷酸相互作用。不過話說回來，對于那些尚未降解成單個核苷酸而呈短鏈狀態的核酸，熒光染料法是無法將其與完整核酸區分開來的。
[咚咚咚！敲黑板！]
但是，紫外吸收法也不是一味的爛，熒光染料法也不是說吊打（大面積吊打還是做得到）。
如果在實驗中獲得的核酸樣品總是很純凈且均一（如原材料是容易對付的培養細胞，還用品質好的試劑盒進行抽提；而非奇奇怪怪的樣品，還要是自己配的試劑），同時產量又很高，那紫外吸收法*可以勝任，外加測定速度熒光染料法。此外，熒光染料法對溫度比較敏感，比如上一回是在25℃室溫制作并儲存的標準曲線，而這一回要測定樣品時實驗室空調壞掉，一下子有了3℃以上的溫差，那么標曲就得重新制作。同時，熒光染料要現用現配，樣品至少要染2 min，花費的時間比紫外吸收法要長。
以下用一張表總結兩者的優劣。請根據自己的實際情況斟酌。
