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專題:脂質體介導DNA轉染法

2013-7-8  閱讀(1609)

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脂質體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質體N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下zui方便的轉染方法之一。轉染率高,優于磷酸鈣法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA轉染到各種細胞。

用LR進行轉染時,首先需優化轉染條件,應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做:*,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從1~5μg和孵育時間6小時開始,按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者*的劑量,確定出轉染時間(2~24小時)。因LR對細胞有一定的毒性,轉染時間以不超過24小時為宜。

細胞種類:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

一、操作步驟[方法一]:

1. 取6孔培養板(或用35mm培養皿),向每孔中加入2mL含1~2×105 個液,37℃CO 培養至40%~60%匯合時(匯合過分,轉染后不利篩選細胞)。

2. 轉染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA,終量100μL,B液:用不含血清培養基稀釋2-50μgLR,終量100μL,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會出現微濁現象,但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,應酌情減量)。

3. 轉染準備:用2mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入1mL不含血清培養液。

4. 轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉染液,換入正常培養液繼續培養。

5. 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。

注意:轉染時切勿加血清,血清對轉染效率有很大影響。

二、快速脂質體轉染法操作步驟如下[方法二]:

1. 以5×105 細胞/孔接種6孔板(或35mm培養皿)培養24小時,使其達到50~60%板底面積。

2. 在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下:

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。

②旋轉1秒鐘,再加入脂質體懸液,旋轉。

③室溫下放置5~10分鐘,使DNA結合在脂質體上。

3. 棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物,37℃培養3~5小時。

4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續培養14~24小時,

5. 吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培養24~48小時。

6. 用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。

四、穩定的脂質體轉染方法如下:

1. 接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉染。

2. DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前2、3步驟。

3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培養48小時。

4. 吸出DMEM,用G418選擇培養液稀釋細胞,使細胞生長一

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