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PCR技術原理剖析- 實時熒光定量
閱讀：2153 發布時間：2013-8-2實時熒光定量 PCR技術原理
聚合酶鏈式反響 （ PCR） 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增。在擴增反應完畢之后，我們能夠經過凝膠電泳的辦法對擴增產品進行定性的分析，也能夠經過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的剖析。無論定性或是定量剖析，剖析的都是PCR終產品。所謂的實時熒光定量PCR即是通過對PCR擴增反響中每一個循環產品熒光信號的實時檢測然后完成對開始模板定量及定性的剖析。在實時熒光定量PCR反響中，引入了一種熒光化學物質，跟著PCR反應的進行，PCR反應產品不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。
熒光擴增曲線擴增曲線能夠分紅三個期間
熒光背景信號階段, 熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光布景信號所掩蓋，我們無法判別產品量的變化。而在平臺期，擴增產品已不再呈指數級的增長。 PCR 的終產品量與開始模板量之間沒有線性關系，所以依據后的 PCR 產品量不能計算出開始 DNA 拷貝數。只要在熒光信號指數擴增階段， PCR 產品量的對數值與開始模板量之間存在線性關系，咱們能夠挑選在這個階段進行定量分析。為了定量和對比的便利，在實時熒光定量 PCR 技能中導入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它能夠設定在熒光信號指數擴增期間任意方位上。每個反應管內的熒光信號抵達設定的域值時所閱歷的循環數被稱為 CT 值（threshold value）。