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技術(shù)文章

真菌/酵母細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒實驗步驟

閱讀：1227 發(fā)布時間：2015-9-15

真菌/酵母細胞線粒體損傷/氧化熒光測定試劑盒實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進37℃恒溫水槽里預熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，將染色工作液置入暗室里。同時開啟熒光顯微鏡或熒光光度儀。然后進行下列操作。

活體染色
準備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107細胞/毫升）
移入到1.5毫升離心管
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
重復實驗步驟5至7一次
加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混勻（注意：參見注意事項6）
放進20℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
加入xx微升預冷的清理液（Reagent A），混勻
即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察（定性檢測）：
移出5微升在載玻片上，放上蓋玻片
即刻進行載玻片壓片（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

或使用熒光分光光度儀

移取500微升染色后的細胞樣品到用戶自備的1毫升比色皿
加入xx微升清理液（Reagent A）
上下傾倒混勻
即刻放進熒光分光光度儀測讀：濾波器激發(fā)波長580nm，散發(fā)波長630nm或濾波器激發(fā)波長495nm，散發(fā)波長519nm：活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對熒光單位（RFU）降低

固定染色

準備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107細胞/毫升）
加入到1.5毫升離心管
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
重復實驗步驟5至7一次
加入xx毫升－20℃預冷的固著液（Reagent D），混勻
放進－20℃冰箱里孵育20分鐘
加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
重復實驗步驟11至13二次
（選擇步驟）置于100瓦超聲儀下，功率20％，猝擊5秒一次（分離集聚一起的細胞）
加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混勻（注意：參見注意事項6）
放進20℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
加入xx毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻
放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
加入xx微升預冷的清理液（Reagent A），混勻
即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察（定性檢測）：
- 移出5,微升在載玻片上，放上蓋玻片
- 即刻進行載玻片壓片（選擇下列其中一種）