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翌圣生物科技(上海)股份有限公司

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技術革新:聚焦翌圣生物熱啟動Taq酶雙封閉抗體

2021-11-12  閱讀(489)

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技術革新:聚焦翌圣生物熱啟動Taq酶雙封閉抗體


非特異擴增是PCR實驗中的常見問題,非特異擴增直接影響檢測結果的判讀并且會導致擴增靈敏度下降,甚至目標片段的得率下降等。此外,檢測試劑的穩定性也是核酸檢測行業人格外關注的問題,不管是長期儲存穩定性還是短期偏離正常保存條件的穩定性,都直接影響檢測結果的有效性。


翌圣生物科技(上海)股份有限公司(以下簡稱“翌圣生物")匠心開發熱啟動Taq酶雙封閉抗體,通過同時封閉Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性來有效提高擴增的特異性及試劑的穩定性。



PART 01

Taq酶雙封閉抗體封閉原理




傳統的Taq DNA聚合酶抗體可以有效抑制Taq酶的聚合酶活性,從而避免錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增。然而Taq酶除了具有5'→3'聚合酶活性,還有5'→3'核酸外切酶活性,這部分外切酶活性可能會在低溫時導致錯配探針或其它物料降解,造成非特異信號。翌圣生物開發的熱啟動Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的有5'→3'聚合酶活性,還能同時封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性,雙管齊下,既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增,又能防止物料降解產生非特異信號,雙重提升試劑穩定性。


圖片1.jpg

圖1. 翌圣雙封閉抗體封閉原理示意圖

圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結構域和5'→3'核酸外切酶活性結構域,翌圣雙封閉抗體含兩種抗體,可同時封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性



PART 02

Taq酶雙封閉抗體使用方案




翌圣生物Taq酶雙封閉抗體不僅可封閉野生型Taq酶,對于多種突變體Taq酶亦可適用,封閉之后的熱啟動Taq酶可以正常保存至-20℃。


1 µL抗體(5 mg/mL)可封閉20-50 U Taq DNA聚合酶:

•  小樣室溫(25℃)旋轉混勻孵育30 min

  大樣室溫(25℃)旋轉混勻孵育2~3 h



PART 03

Taq酶雙封閉抗體性能展示




 1  雙封閉抗體有效封閉Taq DNA聚合酶外切酶活性

將合成的引物探針分別配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應液中,40℃反應,檢測兩者熒光信號。


圖片2.jpg

圖2. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測

黃色:未封閉的Taq DNA聚合酶組;紫色:雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組


由圖2可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。


 2   使用雙封閉抗體分型準確,靈敏度更高

分別用翌圣生物雙封閉抗體以及T公司抗體對Taq酶封閉后通過ARMS-PCR技術檢測陽性樣本。


圖3. ARMS-PCR擴增曲線圖

藍色:T公司封閉抗體封閉;紅色:翌圣雙封閉抗體封閉


由圖3可以看到翌圣生物雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴增中分型準確,靈敏度更高。


 3   雙封閉抗體有效提升檢測試劑穩定性

用傳統封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶,配置成含引物探針的全預混液,在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天,擴增10000拷貝ASFV質粒,觀察擴增曲線和Ct值變化,對比傳統封閉抗體和雙封閉抗體對全預混反應液穩定性的作用。

圖4. 傳統封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應液擴增10000拷貝ASFV質粒擴增曲線圖

藍色:4℃放置10天;紅色:4℃放置0天(對照)


由圖4可以看出,雙封閉抗體比傳統封閉抗體更能保持反應液穩定,有效提升檢測試劑穩定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液4℃放置10天擴增曲線和Ct值無明顯變化。



圖5. 傳統封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應液擴增10000拷貝ASFV質粒擴增曲線圖

藍色:37℃放置5天 ;綠色:37℃放置3天;黃色:37℃放置1天 ; 紅色:37℃放置0天(對照)


由圖5可以看出,雙封閉抗體比傳統封閉抗體更能保持反應液穩定,有效提升檢測試劑穩定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液37℃放置1、3、5天Ct值差小于0.2。


 4   雙封閉抗體幫助解決基線上漂問題

某些引物配合特定buffer和儀器時,會出現基線上漂的情況。翌圣生物嘗試多種方法改善基線問題,發現雙封閉抗體更有利于基線平穩。



圖6. N基因(A)、ACT基因(B)擴增曲線圖

紅色:傳統封閉抗體封閉;綠色:雙封閉抗體封閉


由圖6可以看出特定引物和buffer下,使用雙封閉抗體可幫助解決基線上漂問題。


 5   使用雙封閉抗體獲得良好線性

用雙封閉抗體封閉的反應液擴增100000、10000、1000、100拷貝ASFV/ACT雙質粒,制作標準曲線。


圖7. 雙封閉反應液制作ASFV基因(A)、ACT基因(B)標準曲線圖


由圖7可以看到,ASFV基因標準曲線R2為0.998,擴增效率為98.848%;ACT基因標準曲線R2為0.998,擴增效率為98.113%,兩者線性均良好,且均無非特異性擴增。


 6   雙封閉抗體可快速釋放酶活

分別用進口T公司抗體和翌圣生物雙封閉抗體封閉Taq酶,并在95℃下熱激20 s,檢測酶活。可以看到95℃熱激 20 s后,翌圣生物雙封閉抗體可釋放95%以上的酶活,與T公司抗體相當。


原酶

翌圣生物雙封閉抗體(95℃,20 s)

T公司抗體(95℃,20 s)

酶活-U/μL

2.15

2.1

2.2



 7   雙封閉抗體可封閉多種類型Taq

用翌圣生物雙封閉抗體(Cat#31303)分別封閉三種類型Taq酶(野生型+2種突變型),封閉比例為1μg:5U,測量熒光值以及封閉效率。可以看到,對于不同類型的Taq酶,翌圣生物雙封閉抗體(Cat#31303)封閉效果均較好。



熒光值

封閉效率

空白

6461.74


原酶-Taq000

56221.33


原酶-Taq019E

50819.64


原酶-Taq019H

56466.33


31303-Taq000

7949.68

97.01%

31303-Taq019E

8267.35

95.93%

31303-Taq019H

8015.47

96.90%


 8 
  
Yeasen雙封閉抗體無小鼠基因組殘留

以水為模板作為陰性對照,小鼠基因組為模板作為陽性對照,擴增不同批次的31303,觀察條帶,發現樣品未擴增出目的片段,說明抗體不存在小鼠基因組殘留。


圖片8.jpg

圖8. 小鼠基因組殘留檢測圖

注:-為陰性對照,+為陽性對照,1-5為31303不同批次樣品



PART 04

翌圣生物Taq酶抗體庫,滿足您的多樣化需求




市面上Taq酶突變體種類較多,往往很難找到適配且能高效封閉的抗體,而選擇其他的修飾方式,可能存在修飾效果不佳、熱啟動時間過長等問題。
翌圣生物擁有多種Taq酶抗體組成的抗體庫,除常用的聚合酶活性封閉抗體5'→3'外切酶活性封閉抗體和雙封閉抗體以外,抗體庫中還有40余株抗體,后續可快速開發實現超過200余株抗體,可針對各種商業化Taq酶進行定制化篩選適配封閉抗體,幫助IVD企業快速適配原料縮短研發進程。
抗體庫定制篩選案例展示:
2020年6月12日,客戶C反饋使用翌圣生物通用版Taq酶抗體封閉某Taq酶突變體,封閉效率可達95%,但希望37℃穩定性測試能突破7天,嘗試優化封閉比例未能解決該問題,遂安排寄送客戶的Taq酶至翌圣生物IVD RDC。同年7月20日,翌圣生物從其Taq酶抗體庫里進行篩選,篩選到#301號聚合酶封閉抗體與#2號外切酶封閉抗體對客戶Taq酶有良好的封閉性,混合使用兩種抗體可使Taq酶37℃穩定性測試延長至14天。


創新合作模式下的定制化封閉抗體篩選,翌圣生物Taq酶抗體庫給您多種選擇!


目前翌圣生物為IVD企業已提供的定制化服務除了Taq酶封閉抗體篩選外,其他分子診斷原料包括:免提取、快速程序、自動化儀器適配、小體積反應體系、酶定向改造、防污染體系、凍干試劑等,幫助數百個分子診斷試劑開發項目順利進行,快速推向臨床實驗階段。



如果您對創新合作模式感興趣,歡迎聯系我們,探討交流,我們期待與您的合作!




PART 05

產品信息




產品名稱

貨號

規格

價格(元)

*(元)

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody 

 

31303ES60

100 μg

1153.00

229.00

31303ES80

1 mg

3653.00

1479.00

31303ES90

5 mg

14653.00

6159.00

31303ES92

10 mg

26353.00

11189.00

31303ES93

100 mg

231753.00

74599.00

31303ES94

1000 mg

1969552.00

499999.00



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