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質粒轉染試劑的相關知識點介紹
閱讀：1439 發(fā)布時間：2022-12-15
轉染(transfection)是細胞在一定條件下主動或被動導入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。質粒轉染對于哺乳細胞蛋白的表達至關重要，轉染的方法和步驟直接影響著轉染的成功與否。
質粒轉染試劑適用于24孔板培養(yǎng)的哺乳動物細胞，所有數(shù)量和體積均是按孔計算。大部分細胞系所使用的DNA(μg)與VigeneFection(μg)的比值為1:3或1:4，轉染狀態(tài)良好的細胞可獲得高轉染效率、高表達水平和低細胞毒性。轉染步驟：
1、貼壁細胞：轉染前一天每孔0.5-2×105個細胞接種于500μl培養(yǎng)基中，在轉染時細胞可長至90-95%融合。
懸浮細胞：在配制轉染液前每孔4-8×105個細胞接種于500μl培養(yǎng)基中。
2、轉染液制備，每孔細胞用量如下：
A. 用50μlDMEM培養(yǎng)基(或者其他無血清培養(yǎng)基)稀釋質粒DNA，輕輕混勻。
B. 取適量VigeneFection 在50μl DMEM培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。
C. 將前兩步所稀釋的DNA和VigeneFection 混合，輕輕混勻，室溫放置30min。
3、在每孔細胞中加入混合后的轉染液，輕輕搖勻。
4、貼壁細胞可在轉染4-6h后可更換培養(yǎng)基，懸浮細胞可在轉染后的18-48h之間，對細胞進行換液。轉染18-48h之后可檢測基因表達。如果檢測到蛋白表達，請在轉染后24-72h收集培養(yǎng)液。
5、對于穩(wěn)定轉染，在轉染24h后以1:10傳代培養(yǎng)，第二天可加入選擇培養(yǎng)基。
質粒轉染試劑將外源核酸片段導入細胞，影響內源基因表達水平。在轉染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑，例如在綿羊成纖維細胞轉染過程中FuGene HD的轉染效率更高，GenEscortTM I對小鼠膠質細胞則具有更好的轉染效果。總之，可以遵循低毒等原則進行選擇。在一定范圍內，轉染效率與質粒/轉染試劑比值成正相關，但毒性也會增加。可以根據(jù)轉染試劑推薦比例確定合適的合適的轉染比例。