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【買試劑，找華雅】mRNA轉染IVT攻略：流程及試劑推薦
閱讀：587發布時間：2025-1-15
mRNA轉染的優勢
與DNA相比，mRNA轉染具有以下優勢：
- 高效且可控的表達：mRNA能迅速翻譯為蛋白質，表達短暫且可控，降低過度表達風險。
- 細胞友好：mRNA引入細胞內不易造成損傷。
- 安全性與低免疫原性：mRNA不整合入宿主基因組，降低基因突變風險，降解產物為細胞自然成分。
- 快速響應與靈活性：mRNA快速合成能力使科學家能迅速調整實驗方案。
IVT的主要步驟
模板制備
- 以質粒DNA為起點，通過瓊脂糖電泳鑒定質粒。
- 選擇超螺旋狀態最佳的菌株，進行線性化質粒，選擇合適的限制性內切酶（如BsaI）進行切割。
酶法加帽
- IVT后，使用牛痘病毒加帽酶和mRNA 2'-O-甲基轉移酶為mRNA加帽，增強穩定性。
轉錄反應
- 準備線性化質粒模板，加入轉錄緩沖液、NTPs和RNA聚合酶，在37°C孵育合成大量mRNA。
純化
- 采用柱純化、磁珠純化或酚/氯仿純化等方法，去除雜質，提取純凈的mRNA。
定量與檢測
- 使用紫外吸收法、染料法或毛細管電泳法對mRNA進行定量和純度檢測。
共轉錄法加帽
- 為提高效率，可在IVT過程中直接加入帽子類似物，實現轉錄與加帽同步進行。
IVT的主要試劑
目前市場上有多種成熟的商品化IVT試劑盒，如Thermo Fisher、NEB、諾唯贊、江蘇申基等，均提供完善的解決方案。
轉染試劑選擇
ProteanFect
- 首·款基于蛋白遞送的轉染試劑，非常適合mRNA轉染。
- 在多種難轉染細胞系中效率顯著優于lipofectamine。
ProteanFect在難轉細胞中的應用
- 在Jurkat T細胞中，ProteanFect展現出對多種類型核酸的高效遞送能力。
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