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HPLC方法建立期間，在第一次進樣前，我們必須有把握所選擇的檢測器能檢測到所有的被測樣品組分。通常可變波長紫外(UV)檢測器，因這種檢測器使用方便，且可用于大多數樣品。uV光譜信息對方法建立具有舉足輕重的地位，uv光譜數據可從文件使用”pdf Fact ory”試用版本創建文獻中查找，也可通過所測樣品成分的化學結構估算；直接測得（如果可拿到化合物純品）或在HPLC分離期間用二極管陣列檢測器(PDA）得到。樣品對uv檢測響應不足時，町考慮使用其它類型檢測器(熒光，電化學等)，或衍生化樣品使檢測信號增強。
樣品來源形式不同，可能以如下形式出現：
1．可直接進樣的溶液
2．需稀釋、pH緩沖、加入內標或其它定容操作的溶液
3．必須首先溶解或提取處理的固體
4．樣品需預處理以除去十擾物和／或保護色譜柱或儀器不受損害
可直接進樣的樣品有操作方便、精密度好的優點，然而大多數HPLC分析的樣品需稱重和／或稀釋定容后才能進樣。當樣品溶劑成分接近于流動相時，一般不會產生基線波動等問題，通常能夠得到較好的結果。
有些樣品在注人HPLC前需進行部分分離（預處理），以除去干擾物、濃縮樣品或消除“柱殺手”，因此了解樣品基質和各種被測物的濃度范圍非常重要。許多情況下，建立滿足要求的樣品預處理方法甚至比完成一次良好的HPLC分離更具挑戰性。
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