多光子激光掃描顯微鏡（Multiphoton Laser Scanning Microscopy，簡稱MPLSM）是一種先進的光學顯微技術，它利用兩個或多個光子同時被樣品吸收的非線性光學過程來激發熒光，從而實現對生物樣品深層結構的高分辨率成像。與傳統的光學顯微鏡相比，多光子顯微鏡具有更深的穿透力、更少的光毒性以及更高的空間分辨率等優點，特別適用于活體細胞和組織的長時間觀察。
原理
多光子顯微鏡的核心原理是多光子吸收。在傳統的單光子激發中，一個高能量的光子被熒光分子吸收，激發熒光。而在多光子吸收中，兩個或多個低能量的光子幾乎同時被同一個熒光分子吸收，其總能量相當于一個高能量光子的能量，從而激發熒光。這一過程通常發生在激光聚焦點處，因此具有很高的空間選擇性。
關鍵組件
多光子顯微鏡的關鍵組件包括：
激光器：通常使用飛秒脈沖激光器，因為其短脈沖寬度可以提供高能量密度，有利于多光子吸收過程。
掃描系統：包括掃描鏡和光路系統，用于控制激光束在樣品上的掃描路徑。
探測器：用于收集樣品發出的熒光信號，并將其轉換為電信號，最后形成圖像。
光學元件：如物鏡、分光器等，用于聚焦激光和收集熒光。
優勢
多光子顯微鏡相較于其他顯微技術具有以下優勢：
深層成像能力：由于使用的是紅外光，其散射和吸收較小，因此可以實現對樣品較深層結構的成像。
減少光毒性：由于激發僅限于激光聚焦點，減少了對樣品的光損傷和光毒性，適合長時間觀察活體細胞。
提高分辨率：多光子激發的熒光僅在焦點處產生，因此具有天然的光學切片能力，可以實現三維成像。
減少背景信號：由于激發僅限于焦點處，因此背景信號較低，提高了圖像的對比度。
應用
多光子顯微鏡在生物醫學研究領域有著廣泛的應用：
神經科學：用于觀察活體大腦中的神經元活動和神經網絡。
腫瘤學：研究腫瘤微環境和血管新生。
發育生物學：觀察胚胎發育過程中的細胞動態。
免疫學：研究免疫細胞在組織中的行為。
結論
多光子激光掃描顯微鏡是一種強大的成像工具，它通過多光子吸收原理，克服了傳統顯微鏡的局限性，為生物醫學研究提供了新的視角。其在深層成像、減少光毒性、提高分辨率等方面的優勢，使其成為研究活體組織和細胞的技術之一。隨著技術的不斷發展和優化，多光子顯微鏡將在未來的科學研究中發揮更加重要的作用。
