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N端修飾蛋白（乙酰化、肉豆蔻酰化）的合成
閱讀：497 發(fā)布時間：2024-2-22
N端乙酰化和肉豆蔻酰化是蛋白中最常見的翻譯后修飾之一，它們參與了蛋白的相互作用和亞細胞定位。為了闡明這些翻譯后修飾的重要性，需要比較分析修飾蛋白和未修飾蛋白。但是，在使用大腸桿菌等活細胞制備蛋白的常規(guī)方法中，受細胞中固有的修飾酶影響，難以控制和制備未修飾蛋白和修飾蛋白。
在本研究中，使用僅由參與蛋白合成的因子組成的PURE system（產(chǎn)品名稱：PUREfrex®），探討制備N端修飾目標蛋白的方法，并以wan全可控的狀態(tài)成功合成了乙酰化或肉豆蔻酰化的蛋白。
◆由未甲酰化的初始蛋氨酸合成蛋白
在使用常規(guī)PURE system的蛋白合成中，與大腸桿菌內(nèi)的翻譯反應(yīng)相同，由甲酰化的蛋氨酸進行翻譯。但是，如果初始蛋氨酸的氨基被甲酰化，則不會發(fā)生N端修飾。因此，使用不含甲酰基供體（10-Formyl-tetrahydrofolate10-CHO-THF）的PURE system進行蛋白合成。結(jié)果表明，盡管不使用10-CHO-THF后合成效率有所降低，但仍成功合成了目標蛋白。
◆NatB的N端乙酰化
酵母NatB是一種由yNaa20和yNaa25組成的異源二聚體酶，它能將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至未甲酰化的初始蛋氨酸的氨基上。在不含10-CHO-THF的PURE system中加入目標蛋白、yNaa20及yNaa25的模板DNA和乙酰CoA進行反應(yīng)。通過質(zhì)譜分析合成的目標蛋白的N端肽，確認添加NatB DNA后被乙酰化。
◆NatA的N端乙酰化
酵母NatA是一種由yNaa10和yNaa15組成的異源二聚體酶，它將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至methionine aminopeptidase（MAP）切割初始蛋氨酸時暴露的第二個氨基酸的氨基上。因此，使用NatA進行乙酰化時，必須通過MAP去除N端的初始蛋氨酸。由于MAP會切割未甲酰化的初始蛋氨酸，因在不含10-CHO-THF的PURE system中添加目標蛋白、yNaa10、yNaa15的模板DNA、純化MAP和乙酰CoA進行反應(yīng)。通過質(zhì)譜分析合成目標蛋白的N端肽，確認添加NatA DNA后被乙酰化。
◆NMT的N端肉豆蔻酰化
NMT是一種可將MAP切割初始蛋氨酸后暴露出的第二個甘氨酸的氨基進行肉豆蔻酰化的酶。由于底物肉豆蔻酰 CoA會抑制蛋白合成反應(yīng)，因此需先在不含10-CHO-THF的PURE system中分別合成目標蛋白和NMT。然后，將分別合成的目標蛋白、NMT及肉豆蔻酰CoA混合，進行肉豆蔻酰化反應(yīng)。通過質(zhì)譜分析合成目標蛋白的N端肽，確認添加NMT后被肉豆蔻酰化。
此外，在脂質(zhì)體中進行上述的肉豆蔻酰化反應(yīng)時，可觀察到肉豆蔻酰化的蛋白在脂質(zhì)體膜的定位狀態(tài)。
● 實驗步驟概述（A）
● 去除初始蛋氨酸的GFP通過hNMT1（Δ80）在脂質(zhì)體內(nèi)被肉豆蔻酰化，還可觀察到其向脂質(zhì)體膜遷移（B）
● 根據(jù)3、6、9、12和24 h的反應(yīng)時間繪制GFP膜定位的比率（C）
● 未添加肉豆蔻酰-CoA（D）或hNMT1（Δ80）基因（E）時，無法觀察到GFP的膜定位
該項研究結(jié)果表明，通過使用PURE system，可在wan全可控下制備N端修飾蛋白，還可以確認翻譯后修飾的合成蛋白在脂質(zhì)體膜上的定位。此外，PURE system還能合成修飾酶，無需純化即可用于修飾反應(yīng)。該方法也適用于其他修飾酶，可以簡便地進行各種翻譯后修飾反應(yīng)的分析和應(yīng)用。
該項研究是GeneFrontier、東京工業(yè)大學(xué)和海洋研究開發(fā)機構(gòu)（JAMSTEC）的共同研究。論文發(fā)表在ACS Synthetic Biology，可通過以下鏈接免費下載：
pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.3c00191
“Regulated N-Terminal Modification of Proteins Synthesized Using a Reconstituted Cell-Free Protein Synthesis System"
ACS Synthetic Biology (2023) 12, 1935-1942
相關(guān)產(chǎn)品：
PUREfrex® 無細胞蛋白合成試劑盒：http://labchem.fujifilm-wako.com.cn/product/show/1610.html