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去垢劑兼容型Bradford試劑盒

Detergent-Compatible Bradford Assay Kit

貨號：PD-Cde-1000

組分：1000毫升染色液一瓶，5 mg/ml BSA四支。

保存：4度避光，一年有效。-20度冷凍可長期保存。

在涉及蛋白組學的實驗中，經常需要檢測溶液中的蛋白質濃度。常用的蛋白定量的方法分為兩大類：一類是銅還原法，原理是在堿性環境中利用肽鍵將二價銅還原為一價銅，間接反映蛋白質的數量，如雙縮脲反應、改良Lowry法、BCA法等；另一類是染料結合法，原理是通過染料與蛋白質的結合，使溶液的光吸收峰發生改變，從而反應蛋白質的數量，常用的染料是考馬斯亮藍G250（Bradford法），以及一些金屬-染料復合物，如兒茶酚-鉬酸復合物、鄰苯三酚紅-鉬酸復合物等。

在蛋白質提取和蛋白電泳實驗中，經常會用到還原劑和去垢劑（表面活性劑），上述蛋白定量方法往往與這些還原劑和去垢劑不兼容：還原劑對銅還原法有強烈干擾作用，即使在沒有蛋白的情況下也能產生顯色反應，無論是樣品本身含有的抗壞血酸，或是緩沖液中含有的巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等，均能形成干擾；去垢劑則對染料結合法有強烈干擾作用，如SDS、Triton X100、Tween-20等，會與染料結合使溶液光吸收峰發生改變；高濃度的去垢劑也會對銅還原法產生干擾，但是在常用濃度下一般沒有影響。這些還原劑和去垢劑在蛋白提取緩沖液和電泳相關緩沖液中很常見，傳統上解決這些干擾的方法是通過蛋白沉淀法去除干擾成分，然后重懸蛋白進行濃度測定，其缺點在于顯著增大了工作量，并且增加了實驗誤差。

Bradford法不受絕大部分樣品中的化學物質的影響，也不受還原劑的影響，但是去垢劑可以造成強烈干擾。通過與染料結合，去垢劑抬高背景光吸收值，使得檢測靈敏度和檢測范圍發生改變，甚至無法檢測。本產品通過對Bradford法的改進，降低去垢劑的干擾，可兼容6%SDS、4%Tween20、2% Triton-X100、2% NP40、8% CHAPS，可耐受各種RIPA裂解液，對蛋白組學實驗常用的各種緩沖液均可兼容。

RIPA裂解液是一種傳統的細胞組織快速裂解液，根據其裂解液的強度大致可以分為強、中、弱三類。RIPA裂解液(強)的主要去垢劑成分為1%Triton X-100，1% Sodium Deoxycholate，0.1% SDS；RIPA裂解液(中)的主要去垢劑成分為1% NP-40，0.5% Sodium Deoxycholate，0.1% SDS；RIPA裂解液(弱)的主要去垢劑成分為1% NP-40，0.25% Sodium Deoxycholate。即使樣品含兩倍濃度的RIPA裂解液（強）或RIPA裂解液(中)，本產品也可對BSA蛋白進行濃度檢測，兩倍濃度的RIPA裂解液僅僅引起背景OD值升高約40%。

Bradford法蛋白定量的原理是在酸性環境中，蛋白質結合考馬斯亮藍G250染料，導致染料的最大光吸收峰發生位移，從紅棕色形式（最大吸收峰 465nm）轉化為藍色形式（最大吸收峰 610nm）。這兩種形式在 595nm 處光吸收差異最大，因此 595nm 是測定考馬斯染料-蛋白復合物的藍色的最佳波長。由于G250染料在結合蛋白前后的光吸收波譜有重疊，直接使用OD595線性擬合，得到的是一個直徑很大的曲線，一般情況下可近似看作直線，在蛋白濃度跨度較大時會對線性擬合造成影響。使用OD595/OD470的比值則可以更好地擬合反應過程，得到的是一條直線，可提高檢測靈敏度。本試劑盒檢測BSA蛋白時，線性擬合范圍低可達約30ug/ml，以檢測樣品體積5ul計算，即0.15ug的BSA蛋白；最大檢測濃度可超過4 mg/ml。使用Bradford法蛋白定量時，被檢測的肽或蛋白質的分子量須大于 3KD，低于此分子量的短肽和氨基酸無法檢測。

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