1. 絕大部分干細(xì)胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后，殘留的那些無法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37℃消化。比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育。

2.細(xì)胞如何算是消化好了呢？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實(shí)已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成*分離細(xì)胞，這是沒有必要的。一般能移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細(xì)胞就是*成單個(gè)干細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至*吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因?yàn)橘N壁過程中重新聚集了。這個(gè)時(shí)候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細(xì)胞之后會對你越來越不好。

3.EDTA的作用。胰酶切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA。

4.PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因?yàn)檠逯泻幸种埔让傅牡鞍住τ谝恍╇y消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因?yàn)檫@些離子也會抑制胰酶的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的干細(xì)胞，不需要配制如此溶液。