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細胞瓊脂克隆斑形成實驗方法
1.取MDA-435-OL-Sec23a-GFP和MDA-435-OLLV3NC-GFP對數生長期的細胞制成單細胞懸液, 使用血細胞計數板計數后備用。
2.使用梯度稀釋法適當稀釋細胞懸液后, 向6孔板的每個孔內分別加入含50 個細胞的2 mL細胞懸液, 細胞懸液使用含10% FBS 的DMEM培養液配制。每種細胞均設置3個6孔板復孔。
3.12 h后鏡下可觀察到6孔板內細胞已經全部貼壁, 此時將皿中培養液換成瓊脂濃度為0.2%的含10% FBS的DMEM培養液, 置于37 °C培養箱內培養。
4.10 d后鏡下可觀察到6孔板內出現集落生長的細胞克隆斑。此時棄去含瓊脂的培養液, 用PBS 輕輕潤洗2次, 然后6孔板內每孔加入2 mL冰甲醇固定30 min, 固定結束后使用PBS輕輕潤洗2次, 然后使用結晶紫染色5 min, 再用PBS輕輕潤洗后室溫干燥。
5.干燥完成后將6孔板移至顯微鏡下觀察計數每個孔內細胞克隆斑數量, 超過50個細胞的克隆斑即可計數。根據細胞克隆斑形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%來計算細胞體外克隆率。
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