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細胞凍存和復蘇操作步驟及注意事項

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細胞凍存

1、取待凍存的細胞用胰酶消化,用培養基將細胞沖洗下來。800r/min離心5min,棄上清收集細胞。如果是懸浮培養的細胞,可直接離心收集細胞。

2、加入適量凍存液(10%甘油+90%培養基,或是10%DMSO+90%培養基)制成細胞懸液。細胞濃度宜大,3*106個/ml左右,并可適量增加小牛血清濃度至20%。

3、細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹,做好標記(注明細胞種類、時間、條件等)。

4、凍存管在4℃下存放30min,轉放-20℃1.5h~2h,再轉入-70℃4~12h后即可轉入液氮內(-196℃),注意進行登記。

細胞復蘇

1、取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。

3、取出凍存管,用75%酒精清潔管口,打開。

4、離心去上清收集細胞,用無血清培養基洗1次,加入3ml新鮮培養基,于小培養瓶中培養。

5、每日觀察細胞生長情況,如果死細胞較多,復蘇次日應換液。待細胞長滿后進行傳代培養。

注意事項

1、在使用含有DMSO的凍存液時,因為DMSO在室溫狀態易損傷細胞,所以在細胞加入凍存液后應盡快放入4℃環境中。

2、準確記錄細胞的種類、凍存時間、凍存液的品種和凍存者信息。

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