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高效液相色譜法測定豆類食品中的游離神經遞質類氨基酸
閱讀：222 發布時間：2024-5-8神經遞質類氨基酸是人體內的重要組成物質，參與各種代謝途徑，可通過調控中樞神經元的興奮或抑制，參與神經元信息傳遞、認知、學習和記憶等過程。神經遞質類氨基酸主要有γ-氨基丁酸、天冬氨酸和天冬酰胺等，可分為興奮性和抑制性兩類，興奮性神經遞質類氨基酸包括天冬氨酸等，抑制性神經遞質類氨基酸包括 γ-氨基丁酸等。γ-氨基丁酸參與調節學習和記憶過程[8?9] ，γ-氨基丁酸還能改善睡眠和預防抑郁 ，天冬氨酸與智能、情緒和警覺性有關。天冬酰胺可通過天冬酰胺合酶由天冬氨酸合成，該酶的缺陷會導致大腦結構異常和認知障礙。
神經遞質類氨基酸不僅在神經系統中發揮著重要的作用，在非神經系統中也有重要的生理意義。γ-氨基丁酸能調節免疫、保護和改善胰島功能。人類飲食不僅直接影響身體狀況，也會影響大腦功能和精神狀態。食品是神經遞質類氨基酸的天然來源，飲食調整和補充在神經疾病等許多疾病的治療中有積極的作用。神經遞質類氨基酸廣泛存在于食品中，其中黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆等豆類食品不僅含有豐富的神經遞質類氨基酸，同時也是人們膳食中普遍常見且需要的部分。因此，建立 黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆這 4 種豆類食品中神經遞質類氨基酸的檢測方法非常有必要。
目前，氨基酸和神經遞質的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法、液質聯用（LC-MS） 法、離子色譜法、氣質聯用（GC-MS）法等。其中，液相色譜法和氣質聯用法檢測氨基酸需要做柱前衍生化處理，前處理過程復雜，而氨基酸自動分析儀法耗時比較長。
實驗方法
標準溶液的配制
分別稱取適量的天冬氨酸、天冬酰胺和 γ-氨基丁酸標準品用超純水配制成 1 mg/mL 單標標準品儲備液，儲存于 4 ℃ 冰箱中。取適量各標準儲備液，用超純水稀釋成 0.5 mg/mL 混合標準溶液，用于繪制標準曲線。
液相色譜條件
色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）；柱溫：25 ℃；
流速：0.3 mL/min；進樣量：1 μL。流動相為：A 為 0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 為甲醇；梯度洗脫程序：0~1 min, 30% B；1~2 min，30%~90% B；2~3 min，90% B；3~4 min，30% B。
色譜柱的選擇
分別使用 SB-C18（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）、Zorbax SB-Aq RRHT（3.0 mm×100 mm, 1.8 μm）和 Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm）三種不同的色譜柱對 1 μg/mL 的天冬氨酸、天冬酰胺和 γ-氨基丁酸混合標準品溶液進行檢測，考察色譜柱對目標化合物的分離效果及峰形的影響。
流動相的優化
首先分別使用水-甲醇和水-乙腈作為流動相進行檢測，考察對目標化合物響應強度的影響，然后分別使用 0.1% 甲酸水溶液-甲醇、0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相進行檢測，考察對目標化合物分離度和峰形的影響。
柱溫的選擇
分別使用 20、25、30、35、40、45 ℃ 柱溫進行檢測，考察柱溫對目標化合物響應強 度的影響。
質譜條件
離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監測模式：多反應監測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子化電壓：4500 V；霧化氣（N2 ）壓力：55 psi；氣簾氣（N2 ）壓力：35 psi；輔助加熱氣 （N2 ）為 55 psi；
樣品前處理，采用水作為溶劑，超聲提取目標化合物。分別稱取粉碎后過 60 目篩的黃豆、黑豆、紅小豆和綠豆粉末 2.5 mg 于 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL 超純水，渦旋混勻后，超聲提取 30 s，以 13500 r/min 離心 10 min，取上清液經 0.22 μm 濾膜過濾，供 UPLC-MS/MS 分析。