熒光分光光度計定量分析時多采用工作曲線法，即以已知量的標準物質，按試樣相同方法處理后，配成一系列標準溶液，測定其相對熒光強度和空白溶液的相對熒光強度，扣除空白值后，以熒光強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制工作曲線。
然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強度，扣除空白值后，從工作曲線上求出熒光物質的含量。
在熒光分光光度計用熒光分析法測定某些會引起熒光改變的微量物質時，常采用差示熒光法，可使熒光強度的讀數差距拉大，使熒光強度的降低加大，從而提高方法的靈敏度和準確度。
在使用時需要注意開機次序，光度計開機順序一般為先開氙燈，然后開儀器主機，接著開跟儀器連接的計算機。如此操作的原因在于穩態氙燈是高壓點亮，為了避免瞬問脈沖電流對周圍設備造成影響，需要先開氙燈，等電流穩定后再打開周邊的電腦等設備。關機順序則相反。
熒光分光光度計使用注意事項：
1、樣品應盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發性樣品應使用帶塞的熒光池。
2、在使用儀器進行熒光分析時，為了得到穩定可靠的數據，一般需要開機預熱氙燈大約30分鐘。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預熱時間可以縮短到10分鐘左右。對某些易感光、易分解的熒光物質，盡量采用長波長、低人射光強度及短時間光照。
3、溫度變化可引起儀器熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的明顯程度因樣品而異，大部分熒光物質的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結果幾乎無影響。
4、當儀器的熒光物質是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發生改變，而熒光物質的熒光強度會因其離解狀態發生改變。
5、熒光分光光度計的熒光物質分子與溶液中其它物質分子之間作用導致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、02、硝基化物質、重氮化合物等。
溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質產生不同程度的熒光熄滅現象，因此在較嚴格的熒光實驗中必須除氧。
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