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人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）培養(yǎng)

1 ). 將15-20cm長(zhǎng)的新生兒臍帶放入無(wú)菌的PBS溶液中儲(chǔ)存。

（注：4℃下多貯存24小時(shí)，室溫下不超過(guò)6小時(shí)，否則廢棄）

2 ). 用一個(gè)鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無(wú)菌的PBS溶液沖洗3-5次，將污血沖洗干凈為止。

3 ). 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u動(dòng)臍帶。

4 ). 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開(kāi)，消化液流入一個(gè)50 ml無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌的PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

5 ).將收集液離心（2000轉(zhuǎn)/分）3分鐘。

6 ).倒去上清，加入10ml M199培養(yǎng)基（加入10U/ml的bFGF），用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個(gè)用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。

（注：每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無(wú)菌的1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液*鋪滿瓶底，放入37℃孵育，少2小時(shí)，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被有利于細(xì)胞貼壁。）

7 ). 培養(yǎng)24小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入10 ml新鮮的 M199培養(yǎng)基。

8 ). 以后每2天換一次培養(yǎng)基（每次換掉2/3的培養(yǎng)基）。

9 ).一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長(zhǎng)滿至80-90%單層，這時(shí)可以傳代。

10 ).倒掉培養(yǎng)基，用無(wú)菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

11 ).用彎管將細(xì)胞吹打下來(lái)，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)50 ml無(wú)菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘。

12 ).倒掉上清,加入10ml新鮮培基,一般一瓶細(xì)胞可傳代3-4瓶.以后照此傳代培養(yǎng).

        一般傳代2-3代（培養(yǎng)了20天左右）用于做各種實(shí)驗(yàn)效果很好。