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沒想過我養的細胞會凍壞，過來人告訴你幾點經驗總結
閱讀：1031 發布時間：2018-10-8想要長期持有一個細胞系，策略是進行低溫保存。這可以有效防止因污染或技術原因導致的細胞損失。而低溫保存對于維持細胞株的遺傳特性也極為重要。
看似簡單的凍存細胞，如果操作不當，將導致長期培養的細胞付之東流。作為一個吃過虧的人，告訴你細胞凍存是否成功取決于以下四個關鍵因素（文章結尾有福利，等不及的小伙伴可以拉至底部）。
一、適當的處理及溫和收集細胞
凍存前檢查
凍存前，細胞應處于指數生長期，確保細胞處于健康狀態。理想情況下，應在收獲細胞前 24 小時更換培養基。建議對培養物進行微生物污染物，特別是支原體的檢測，并通過適當的方法，如 STR 分析確定其身份。
如果在培養過程中使用抗生素，那么建議在冷凍前 1 到 2 周不使用抗生素，這樣如果出現污染，可以更容易地發現。
收集細胞
通常，您可以使用常規用于細胞傳代的實驗程序來收獲細胞。細胞收獲期間盡可能溫和操作。本程序推薦的試劑量是針對為 75 平方厘米（T-75）培養瓶；若使用其他培養容器，請相應調整所用試劑量。
1. 使用無菌吸管，取出并丟棄培養基。請妥善處置與細胞接觸的任何材料和溶液。
2. 用 5 到 10 ml CMF-PBS 沖洗細胞，去除所有痕量的血清。
3. 加入 3 到 5 ml 的胰酶（在 CMF-PBS 中），37℃ 孵育。預熱酶溶液通常會縮短處理時間。
4. 在倒置相差顯微鏡上每隔幾分鐘檢查酶處理的進展情況。一旦細胞變圓，輕輕敲擊細胞瓶使其脫離塑料表面。加入 5 ml 含血清的生長培養基滅活胰酶。可能需要劇烈的移液操作來使培養容器底部的剩余細胞脫落，或將細胞團塊分解成單細胞懸浮液。胰酶的去除或失活對于冷凍細胞至關重要。如果游離試劑不能直接滅活，可以通過下一步的離心去除。
5. 用 15ml 離心管收集細胞。取出樣本進行細胞計數，剩余的細胞懸液以約 100×g 離心 5 分鐘以獲得細胞沉淀。離心時，用細胞計數板對細胞進行計數。使用臺盼藍染液檢查細胞的活性。
二、使用合適的冷凍保護劑
5%～10% 的甘油和 DMSO 是常見的凍存保護劑。雖然 DMSO 對細胞有毒性，但是與甘油相比，其滲入細胞的速度更快，而且凍存重復性更好（細胞復蘇效率更好）。
但是，DMSO 一方面會導致某些細胞（如 HL-60 早幼粒細胞）分化，另一方面對某些細胞（如 HBE4-E6/E7 肺上皮細胞）的毒性也過大。對于這些細胞，則應使用甘油。甘油可以通過高壓蒸汽滅菌，而 DMSO 只能通過過濾除菌。DMSO 或者甘油至少應達到試劑級（或者更別，如細胞培養級），并且分裝，避光保存。
三、細胞凍存的速率
有很多方法可以實現 1℃/min 的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統是的方式，可以保持降溫速度。這也是 ATCC 采用的方法。但這種設備價格較高。比較經濟的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于 –70℃ 的冰箱中凍存 24 小時。已有一些商業化凍存盒產品能夠非常接近 1℃/min 的理想降溫速度。
四、合適的儲存溫度
長期保藏需要超低溫（低于 -130℃）環境，可以使用低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。
要維護液氮中儲存的細胞需要記住以下幾點：
1. 確保標簽系統適用于低溫儲存。
2. 保持良好記錄，包括細胞儲存位置，生長特點和操作記錄。
3. 請頻繁檢查液氮罐的狀態（每天或至少每周一次）。有多種商用警報系統可用于持續監控其狀態。珍貴細胞應至少存放在兩個不同的地點。
后，關于養細胞這件小事，還想提醒大家一句：如果你購買了 ATCC 細胞系，為了保證培養基一致性的問題，購買細胞時，一起購買推薦培養基。因為來自于不同廠家的培養基，即使名字相同或類似，配方也略有差異。