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小鼠胚胎干細胞
閱讀：432 發布時間：2018-12-12小鼠胚胎干細胞培養實驗實驗方法原理 胚胎干細胞在體內外可以分化為各種類型的細胞。我們的體外分化方法有利于神經前體細胞通過在少量的培養基內選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴增（第4步）并終分化在第5步。細胞全程培養在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。一般體外誘導向神經細胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進行誘導。
實驗材料 小鼠
試劑、試劑盒 明膠PBSDMEM馬血清L-谷氨酰胺HEPESβ-巰基乙醇PESTLIF
儀器、耗材 培養板離心管水浴鍋離心機6孔板24孔板
實驗步驟
一、ES培養基
在LIF存在的條件下維持細胞培養。
二、EB培養基
使用細菌培養皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1. 分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）。
2. 純化2小時后將細胞轉入含有ES培養基的50 ml Falcon管中，計數細胞取適量體積放入15 ml管中離心3分鐘。
3. 用2mlEB培養基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
4. 一個15 cm的細菌培養皿接種4～5×106個細胞（1個*融合的組織培養皿通常足以接種4個同樣規格的細菌培養皿）。
5. 2天后更換培養基，將胚狀體轉入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養基并接種在新的細菌培養皿中。
6. 用EB培養基培養的第4天將細胞轉入沒有包被的組織培養皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養皿之中放置1個細菌培養皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規格的培養板上。
7. 形成胚狀體需要4天時間。在EB培養基中再培養1天使胚狀體粘附在組織培養皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培養基
在少量培養基中選擇神經前體細胞
1. 胚狀體接種在組織培養皿一天后將培養基換成ITSFn培養基。
2. 并非所有胚狀體在這一時期都已經發生粘附，因此在移除培養基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養皿內。
3. 保持細胞在ITSFn中培養大約10天，根據需要更換培養基--大約每隔一天。
4. 觀察細胞形態，神經樣細胞大約出現在第4到第7天。當神經樣細胞能夠被鑒別時，轉入到第4步。步驟的轉換應該在神經前體細胞出現個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
四、N3培養基＋bFGF
通過將神經前體細胞培養在含有10ng/ml bFGF的培養基中進行擴增。
1. PBS洗滌，加入1-2 ml 胰酶。
2. 37℃孵育5分鐘。
3. 用4mlEB培養基終止胰酶活*，將細胞轉入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
4. 將細胞重懸于含有bFGF的N3培養基。
5. 將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（將蓋玻片放于24孔培養板或6孔培養板，6孔培養板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使大可能的獲得樣品數量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106 /孔。
6. 2天后更換培養基。
五、N3培養基
通過撤除bFGF使神經前體細胞分化。
1. 細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養基換成不含bFGF的N3培養基。
2. 根據需要換液（大約每隔一天）。
3. 分化10～15天后固定細胞。
4. 移除培養基。
5. PBS洗滌，加入4%福爾馬林，室溫放置30分鐘，PBS洗滌2次儲存于PBS。
6. 長期儲存使用含0.01%疊氮化納的PBS。
六、移植細胞的準備
細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉種到組織培養板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10 cm的培養皿。
1. 將胚狀體轉移至一15 ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
2. 去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1×PBS中。
2. 離心3分鐘。
3. 去除上清加入1×胰酶（10 cm的培養皿加1 ml）。
4. 37℃水浴5分鐘。
5. 加入5 mlEB培養基小心吹打約10次。
6. 小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
7. 離心2分鐘。
8. 吸出上清將細胞重懸于500 μl EB培養基。
9. 用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。
10. 離心2次。
11. 吸出上清將細胞重懸于100 μl EB培養基。
七、煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
1. 準備一10 μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）。
2. 加入1 mg（你能稱到的小量）到5 ml EB培養基（制成200 μg/ml）。
3. 將溶液稀釋成10 μg/ml （100 μl 200 μg/ml 溶液和1.9 ml EB培養基）。
4. 如前所述將細胞重懸于2 ml煙酸已可堿染液而不是EB培養基中制備ES細胞懸液。
5. 將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘。
6. 離心2分鐘。
7. 吸出上清將細胞重懸于2 ml EB培養基。
8. 重復一次。
9. 離心2分鐘。
10. 吸出上清將細胞重懸于100 μl EB培養基并置于冰上。
收起
注意事項
1.需要采用高純度的水進行培養細胞。
2. 必須要在無菌的環境下操作實驗。
其他
1. 在沒有添加LIF的條件下，培養在飼養層上的ES細胞克隆形成率和AKP染色陽性度顯著高于無飼養層培養的ES細胞。
2. 在LIF添加量達到l000IU/ml時，外源LIF與飼養層產生的基質型LIF在維持未分化狀態作用中存在有主從關系。
3. 當沒有外源LIF或量不足時，飼養層產生的分化抑制作用才會在分化抑制中發揮主要作用。