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細胞凋亡檢測實驗之TUNEL 法
閱讀：1068 發布時間：2019-3-19實驗方法原理 細胞凋亡中, 染色體DNA 雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA 的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。
TUNEL 實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
Caspase-3 活性的檢測
實驗方法原理 Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用， 其中caspase-3 為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3 由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3 的活性明顯下降。
實驗步驟
一、Western blot 分析Procaspase-3 的活化，以及活化的Caspase-3 及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集細胞→PBS 洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 電泳→硝酸纖維素膜或PVDF 膜轉移→5 %脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h 或4 °C 過夜→Caspase-3 多抗或單抗室溫反應1~2 h 或4 °C 過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3 次，5~10 min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG 或AP 標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2 h→ TBS-T 洗3 次， 5~10 min/次→ECL 顯影或NBT/BCIP 顯色。
二、熒光分光光度計分析
1. 原理：活化的Caspase-3 能夠特異切割D1E2V3D4-X 底物，水解D4-X 肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC 才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC 熒光強度的大小，可以測定caspase-3 的活性，從而反映Caspase-3 被活化的程度。
2. 方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS 洗滌，制備細胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3 四肽熒光底物），37 °C 反應1 h，熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380 nm，發射光波長為430-460 nm）。
三、流式細胞術分析
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞，PBS 洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37 °C 反應1 hUV 流式細胞計分析caspase-3 陽性細胞數和平均熒光強度。