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小鼠腫瘤壞死因子-a ELISA 試劑盒
閱讀：361 發布時間：2020-6-8背景介紹：
TNF-α是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生。小鼠的 TNF-α基因長約 2.78kb，由 4 個外顯子和 3 個內含子組成。小鼠 TNF-α前體含 235 個氨基酸殘基，信號肽 為 79 氨基酸殘基。成熟的小鼠 TNF-α分子量為 17kDa，由 156 個氨基酸殘基組成。鼠與人 的 TNF-a 有 79％氨基酸有同源性，TNF-α的生物學作用無明顯的種屬特異性。TNF-α的生 物學活性非常復雜，包括對造血、免疫和炎癥的調節，對血管和凝血的影響及多種器官（肝、 心臟、骨、軟骨、肌肉和其它組織）的作用
檢測原理：
小鼠腫瘤壞死因子-a ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將 抗小鼠 TNF-a 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本， 標準品和樣本中的小鼠 TNF-a 會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗 小鼠 TNF-a 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠 TNF-a 發生特 異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會 發生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的 小鼠 TNF-a，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反 應孔會變成黃色；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD）， 樣本中的小鼠 TNF-a 濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出 樣本中小鼠 TNF-a 的濃度。
原理圖：
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注意事項：※※※
1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請 用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。
安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操 作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本 及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規定執行。
試劑盒組成及儲存：
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自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存： 1. 細胞培養上清： 將細胞培養基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀， 請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作 為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標 物檢測濃度高于標準品的高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實 驗以確定稀釋倍數。
試劑準備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現 結晶，請放入 37℃溫浴直到結晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍 濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標準品中，靜置15分鐘待 其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度：2000、1000、 500、 250、 125、62.5、31.25、 0 pg/ml進行稀釋。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應 廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
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4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃 縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。 生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下
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5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將40倍濃縮酶 結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。
酶結合物工作液具體稀釋方法如下：
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6. 洗滌方法： ? 自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/ 孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。 ? 手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
檢測步驟：
結果判斷： 1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行 雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。 2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值 3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中TNF-a含量 可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。 4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。
參數表征： 1. 數據及標準曲線
本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠 TNF-a 的樣本含量 2. 靈敏度： 低可檢測小鼠 TNF-a 濃度達 15pg/ml， 20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。 3. 特異性： 不與小鼠G-CSF 、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、3、5、6、7、9等反應，人的TNF-α、TNF sRI、 TNF sRII等反應 4. 重復性： 板內，板間變異系數<10% 5. 回收率： 在選取的健康小鼠血漿、細胞培養上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 TNF-a，計算回收 率。
6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細胞培養上清中加入高濃度小鼠 TNF-a，在標準曲線動 力學范圍內進行稀釋，評估線性。
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