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從小鼠中分離內皮細胞
閱讀：210 發布時間：2018-9-3內皮細胞分布于整個循環系統，從心臟到小的毛細血管。在這個步驟中，氣管的活力很非常重要。取出器官和開始消化之間的時間越短將提高細胞更有活力的產出及不在含氧量低的條件下太久。小鼠的數量需要：小鼠應該是5~6周大小。年齡大的小鼠內皮細胞的產出會少些。少5個小鼠可以得到很好的產出。
一、材料和試劑
1. 內皮細胞生長添加劑（ECGS）（Sigma，catalognumber：E2759）
2. 膠原酶I（Invitrogen，Catalognumber：17100-017）
3. BSA
4. DMEM
5. FCS
6. Antibiotic
7. Heparin
8. F12medium
9. Isoflourane
10. Ethonol
11. Dynabeads
12. anti-CD31antibody（BDPharmingen，catalognumber：550274）
13. M199
14. gelatin
二、設備
1. 離心機
2. 無菌培養櫥
3. 磁鐵
三、步驟
1. 取小鼠的肺
（1）麻醉小鼠直到小鼠半睡。我們通常用吸入的麻醉劑例如異氟醚。
（2）用70%乙醇消毒小鼠的皮膚和手術器械。橫切小鼠，低但平行于膈，然后穿過肋骨切開暴露胸腔，迅速切除肺，放到冰上預冷的DMEM。一旦所有的肺都取好后，移到無菌培養櫥進行下面的步驟。
（3）切碎肺組織，清洗幾次去除血液，用3 ml 消化液37°C培養45分鐘（3×15 min withpipettingbetween）離心。
（4）將肺組織切的更細（到大約1 mm 的碎片）并放到5 ml 消化液中37度消化。用手不斷晃動混合物，每五分鐘換一次消化混合物。為了這樣做，離下碎片，去除上清，用5 ml 預熱的消化溶液代替培養基并繼續混合。
（5）加入1/10體積的血清到消化溶液中。這將失活酶并讓細胞附著。將細胞放到組織培養塑料上1小時。這個預鋪讓成纖維細胞附著而不是內皮細胞（EC）。
（6）去除未附著的細胞，離心200×g 5 min，然后直接進入富集步驟。
2. 富集內皮細胞
用抗體包被免疫磁珠分離內皮細胞：加入25 ul 免疫磁珠（1x107）到一個1.5 ml 離心管中，用1 ml PBS洗磁珠兩次，加入100 μg anti-CD31抗體到100 μl PBS到免疫磁珠并4°C慢搖24小時。用磁鐵收集anti-CD31包被的磁珠。當管在磁鐵里時去除上清，4°C用PBS洗磁珠洗3次，一次10分鐘，終4°C過夜。用磁鐵收集磁珠，去除上清。4°C，用500 μl PBS/0.1%BSA重懸，使到達一個2×107beads/ml 的終濃度。
3. 用磁珠分離內皮細胞
（1）在離心細胞后（200×g，5 min），加入15%FBS+M199。37°C，用15%FBS+M199洗細胞3次，200×g，5 min 沉淀細胞。
（2）在1-2%FBS+M199重懸，使終濃度為10-40×106cells/ml。
（3）按1：10比例磁珠加入到內皮細胞中（內皮細胞大約為總細胞的0.02%）
（4）4°C旋轉珠沉淀物30分鐘。將管放到磁鐵上2-3分鐘，去除上清，用2 ml M199重懸磁珠。重復4次。
（5）為了從anti-CD31抗體包被的磁珠中釋放細胞，加入含5 mM EDTAPBS并37°C旋轉10分鐘。
（6）洗完四次后，將珠放到培養培養基中。對于培養鼠的內皮細胞，在鋪細胞前，預先用0.2%明膠包被平板