人肺癌成纖維原代細(xì)胞公司出售的產(chǎn)品：大鼠原代口腔粘膜成纖維細(xì)胞 RAG(小鼠腺癌細(xì)胞) 2F7 人肺癌雜交細(xì)胞 1ml/T75 SKOV3/Taxol-25, 人癌耐藥細(xì)胞株 Human MouseM 小鼠肌肉細(xì)胞 大鼠原代乳腺成纖維細(xì)胞

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細(xì)胞屬性：

方法簡(jiǎn)介

實(shí)驗(yàn)室分離的人肺癌成纖維采用 - 膠原酶混合酶消化后差速貼壁制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的人肺癌成纖維經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

 

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

人肺癌成纖維細(xì)胞分離自肺癌組織；肺癌是常見(jiàn)的肺原發(fā)性惡性腫瘤，絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管粘膜上皮，故亦稱支氣管肺癌。肺癌可向四周乃至全身擴(kuò)散。肺癌發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)快，對(duì)人群健康和生命威脅大的惡性腫瘤之一。近50年來(lái)許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不明確，大量資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。肺癌，其實(shí)不是一種病，而是幾十種病的組合，有多種亞型，多種特性；根據(jù)肺癌細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)特點(diǎn)，可以初步分為兩種類型：小細(xì)胞肺癌(SCLC)15%和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)85%。這兩種類型肺癌的生長(zhǎng)特點(diǎn)、擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)和治療方案均不相同。絕大多數(shù)肺癌是非小細(xì)胞肺癌，約占85%。它又能進(jìn)一步被分為三類，分別是：腺癌，鱗癌和大細(xì)胞癌。其中腺癌是主要的類型，約占非小細(xì)胞肺癌中的50%。如果是不吸煙的女性患者，幾乎全部都是腺癌。人肺癌成纖維細(xì)胞是肺癌組織中的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast，CAF)在腫瘤微環(huán)境中的重要作用已受到廣泛的重視。該細(xì)胞通過(guò)與癌細(xì)胞的直接接觸、分泌多種因子以及對(duì)腫瘤基質(zhì)的改造，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移甚至耐藥性的發(fā)生。隨著研究的深入，有人提出CAF可能成為抗的新靶點(diǎn)。然而CAF的分化來(lái)源多樣，相應(yīng)的形態(tài)和功能各異，因此深入了解CAF的分化來(lái)源有利于更全面地認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)展的機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)，體外培養(yǎng)肺癌成纖維細(xì)胞對(duì)肺癌研究有重要意義。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

人肺癌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及正確的操作方法來(lái)培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作步驟：

1.將無(wú)菌的蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細(xì)胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過(guò)氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細(xì)胞特異性一抗孵育：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周?chē)疂n吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色的陽(yáng)性信號(hào)時(shí)用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復(fù)染：用Harris蘇木素復(fù)染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍(lán)。

10. 封片：將中性樹(shù)膠滴在爬片一側(cè)，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側(cè)再輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好的爬片平放置于通風(fēng)廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

公司產(chǎn)品：