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技術(shù)文章

實(shí)驗(yàn)室菌種應(yīng)用全面解析

閱讀:247          發(fā)布時間:2024-4-16

幾種菌株概述:

標(biāo)準(zhǔn)菌株:直接從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認(rèn)為第0代菌株。  

標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株:將標(biāo)準(zhǔn)菌株在實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)接一代后得到的一套相同的獨(dú)立菌株。通常為第1代或第2代菌株。  

儲備菌株:從標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的培養(yǎng)物。通常為第2代或第3代菌株。  

工作菌株:由標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株、 儲備菌株或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(經(jīng)證明或未經(jīng)證明) 轉(zhuǎn)接一代獲得的菌株。通常為第3-5代菌。傳代:每一次的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)都是一次傳代的過程,可以使用液體、固體或半固體培養(yǎng)基。

注意事項(xiàng):菌株傳代只能由上往下傳,儲備菌株可以做為工作菌株使用,但工作菌株不能做為儲備菌株使用。實(shí)驗(yàn)室使用的工作菌株一般不可超過第5代。常用培養(yǎng)基種類:斜面培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、平板培養(yǎng)基。接種方法:涂布法、劃線法、穿刺法、直接加入法等。

菌種的復(fù)蘇與保存應(yīng)在超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

一、菌種的復(fù)蘇

把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支,移入超凈工作臺或生物安全柜。

先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干,用75%乙醇棉擦凈,放在滅菌雙碟內(nèi),待干。點(diǎn)燃酒精燈,將菌種管的封口一端在火焰上,燒灼紅熱,用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,滴在灼熱的菌種管封口一端,使驟冷而炸裂。

取滅菌鑷子,在火焰旁,將炸裂的管口打開,放入滅菌雙碟內(nèi),另取1支滅菌滴管,在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許,加至菌種管底部,將凍干菌攪動促使溶解,隨即吸出管內(nèi)菌液,分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi),并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi),將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。

取出培養(yǎng)物,仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢,呈典型菌落后,轉(zhuǎn)種3代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型,可進(jìn)行平板分離單菌落。

二、菌種的傳代與保存

1:菌斜面(保存)

培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備,如斜面已無冷凝水者,不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。

至冰箱取出的菌種斜面,應(yīng)在室溫放置約30分鐘,待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。

點(diǎn)燃酒精燈,用左手握住菌種斜面,將管口靠進(jìn)火焰旁,右手拿接種棒后端,將接種環(huán)燒紅30秒,隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼,往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼,右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞,撥開棉塞,將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下,稍冷卻再移至菌苔上,刮去少量菌苔,隨即取出接種棒,并將菌種管口移至火焰旁。

堵上棉塞,左手將菌種管放下,取營養(yǎng)瓊脂斜面1支,照上述操作打開棉塞,將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部,由底向上,將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動,使細(xì)菌劃在斜面的表面上。

取出接種棒,在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上,然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。

將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時,霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存,一般 3個月轉(zhuǎn)種一次。

2:菌斜面-營養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面

如果菌落形態(tài)不典型可純化,按下列方法傳代(分離菌落):用接種環(huán)取上述菌管(斜面)菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支,已滅菌),置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后,再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液(濃菌液),接種于分離平板,置35~37℃培養(yǎng)18~24小時,用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面,置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管,其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中,其它用做工作菌種。

常用分離平板包括:大腸埃希菌——EMB瓊脂平板;銅綠假單胞菌——溴化十六烷*銨瓊脂培養(yǎng)基;金黃se葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。

三、菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜,放置室溫后,用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支,已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時,取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。

四、對照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液(濃菌液1mL,加到9mL,0.9%無菌氯化鈉溶液混勻,為10-1,再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL,0.9%無菌氯化鈉溶液混勻,為10-2……以此類推,稀釋至含活菌數(shù)在50 ~ 100個。用平板計(jì)數(shù)。此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽性對照,可在1天內(nèi)使用。

五、菌種保管

菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé),保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處,確保菌種安全。因工作變動時,必須做好交接工作。菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本,包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能,并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異,如,發(fā)現(xiàn)污染和變異時,應(yīng)及時更換。購置菌種,應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單,并定期向部門負(fù)責(zé)人報告。


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