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逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）實驗步驟及注意事項
閱讀：341 發布時間：2024-5-20 逆轉錄-聚合酶鏈反應 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取組織或細胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，采用 Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。
實驗步驟：
一、總 RNA 的提取
按照總 RNA 提取實驗步驟提取組織或細胞中的總 RNA。
二、cDNA 第一鏈的合成
目前試劑公司有多種 cDNA 第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
1、在 0.5 ml 微量離心管中，加入總 RNA 1～5 μg，補充適量的 DEPC H2O 使總體積達 11 μl。在管中加 10 μM Oligo（dT）12～18 1 μl，輕輕混勻、離心；
2、70℃ 加熱 10 min，立即將微量離心管插入冰浴中至少 1 min；
3、取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl。輕輕混勻，離心。42℃ 孵育 2～5 min；
4、加入 SuperscriptⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min；
5、于 70℃ 加熱 15 min 以終止反應；
6、將管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解殘留的 RNA。-20 ℃ 保存備用。
三、PCR
1、取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
2、加入適量的 ddH2O，使總體積達 50 μl。輕輕混勻，離心；
3、設定 PCR 程序。在適當的溫度參數下擴增 28～32 個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在 PCR 擴增目的基因時，加入一對內參（如 G3PD）的特異性引物，同時擴增內參 DNA，作為對照；
4、電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果；
5、密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。
注意事項：
1、在實驗過程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在總 RNA 的提取過程中，注意避免 mRNA 的斷裂；
2、為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；
3、內參的設定：主要為了用于靶 RNA 的定量。常用的內參有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。
4、其目的在于避免 RNA 定量誤差、加樣誤差以及各 PCR 反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；
5、PCR 不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標 DNA 起始的數量有關。
6、故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定；
7、防止 DNA 的污染： 采用 DNA 酶處理 RNA；在可能的情況下，將 PCR 引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和 mRNA 的共線性。