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技術文章

BCA蛋白濃度測定試劑盒實驗測定方法

閱讀:522          發布時間:2024-12-3

     BCA 蛋白定量法是一種快速靈敏、穩定可靠的蛋白定量測定方法,其測定范圍是10-2000ug/ml,是比Lowry 法更優的專用于檢測總蛋白質含量的產品。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。其在562nm 處有最大的吸收值,通過與標準曲線對比,即可計算待測蛋白的濃度。
原理: BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑,混合一起顯示為蘋果綠色,即BCA 工作試劑。在堿性條件下,BCA 與蛋白質結合時,蛋白質將Cu2+還原為Cu+,一個Cu+螯合二個BCA 分子,工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復合物,最大光吸收強度與蛋白質濃度成正比。

測定方法:(96孔板)
1、配制BCA 工作液: 根據標準品和樣品數量,按50 體積試劑A,1 體積試劑B 配制適量BCA 工作液,充分混勻。
2、將蛋白標準品按0, 1, 2, 4, 6,8, 10 微升加到96 孔板的蛋白標準品孔中,加滅菌雙蒸水補足到10 微升;取10 微升待測樣品加入96 孔板。每個測定要做2-3 個平行.
3、向帶測樣品孔和蛋白標準品孔中加入200 微升BCA工作液(即樣品與工作液的體積比為1:20)混勻。
4、37℃溫浴30min。冷取至室溫。
5、酶標儀562nm 波長下測定吸光度。
6、制作標準曲線,從標準曲線中求出樣品濃度。
注意事項:
1、反應顏色的深淺除了與樣品的蛋白質濃度相關外,還與反應的溫度有關。如果樣品
的濃度較高(>50μg/ml),反應溫度一般采用37 度。如果樣品蛋白質的濃度較低
(<50μg),反應的溫度為60℃,該溫度下,色氨酸、酪氨酸和肽鍵得到充分氧化,大
大提高檢測靈敏度。
2、該方法檢測的蛋白質濃度范圍20μg-500μg/ml;當蛋白濃度<20ug/ml 時,推薦60℃
溫浴,并將蛋白液:工作液的比例調至1:8 進行測定(增強法)可以檢測到5ug/ml。
試劑A 和B 在室溫的穩定期至少1 年以上。標準蛋白液保存在-20℃,短期則4℃保存.

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