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產品概述 product description

保存溫度

2-8℃避光

注意事項

1.MMP-13 底物短期 4℃避光保存，長期-20℃避光保存:。 2.MMP-13 底物在冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。融解后離心至管底部再打開螺旋蓋。 3.可以用手捂住使其融解或 37℃短時間水浴， 4.有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期。 5.試劑拆封后請盡快使用完。

有效期

一年

檢測方法

熒光酶標儀/熒光光度計

適用樣本

細胞/組織

儀器準備

1.熒光酶標儀/熒光光度計； 2.離心機； 3.移液器； 4.冰箱； 5.冰盒；

試劑準備

1.PBS; 2.蛋白定量試劑盒

耗材準備

1.離心管； 2.吸頭； 3.一次性手套； 4.熒光檢測專用的黑色96孔板

使用注意事項

1.37℃下反應如果顏色變化不明顯，可以適當延長反應時間。 2.如果樣品中蛋白含量低，加大樣品量，裂解樣品時需設法使樣品中的蛋白量達到 200-500 ug每樣。 3.如果樣品中激活的MMP水平很低，適當調節誘導細胞凋亡的時間，找一個 MMP 激活比較強的時間點進行檢測。 4.MMP-13 底物避光保存，使用過程中盡量避光。 5.底物為 DMSO 溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。 6.使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進行簡短離心使 DMSO 溶液集中于管底。 7.酶標儀檢測必須使用熒光檢測專用的黑色 96 孔板。

使用方法

一、裂解緩沖液和檢測緩沖液配制根據待測樣品數準備裂解緩沖液和檢測緩沖液，每1ml緩沖液中加入 10 ul DTT 充分混勻置冰上備用。二、樣品處理 A.細胞樣品 1.收集 5x10（6次方）個細胞，在 4℃，500xg 條件下離心5分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。 2.用冷 PBS 洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。 3.在細胞中加入 50 ul冷的裂解緩沖液，高速渦旋振蕩15 秒。 4.置冰上持續振蕩 20-45 分鐘。 5.在 4℃，12000xg 條件下離心 15 分鐘。 6.快速將上清吸入另一預冷的干凈離心管，置于冰上保存備用 B組織樣品 1.取適量組織樣本剪碎，按照每 50 mg/100 ul冷的裂解緩沖液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體，冰上振蕩 20-45 分鐘，小心將上清吸入另一預冷的干凈離心管。 2. 在 4℃，12000xg條件下離心5分鐘。 3.快速將上清吸入另一預冷的干凈離心管，置于冰上或-80℃冰箱保存備用三、對上述處理過的上清進行蛋白定量。【注】: 1.必須進行蛋白定量，以保證后續步驟的蛋白上樣量足夠，否則容易出現檢測不到結果的情況。 2.用 BCA 蛋白定量試劑盒進行定量的話，裂解液中不要加入 DTT。四、MMP1活性檢測 1.取 50ul 裂解上清(含 100-200 ug 蛋白)，加入 45ul 檢測緩沖液。 2.再加入 5 ul MMP-8 熒光底物，充分混勻，在 37℃下避光反應 1-2 小時。 3.熒光酶標儀檢測熒光強度。Ex=325 nm，Em=400 nm。 4.根據凋亡的細胞的熒光值與對照細胞樣本的熒光值的比值計算相對的MMP1 活性程度變化。

常見問題分析

熒光強度值偏低 1.樣品上樣量不夠:本方法檢測需要的細胞數量須在3x10（6次方）以上，或者新鮮組織 50 mg 以上，每次反應的蛋白量需要在 100 μg 以上。如果量不夠，請增加細胞或組織的量。 2.樣本不新鮮:使用新鮮的細胞或組織樣本。 3.樣品裂解不夠充分:細胞或組織需要進行充分裂解，可以加入適當的蛋白酶抑制劑混合物裂解，裂解后應無明顯大量的沉淀，以保證有效獲得蛋白。 4.樣品中激活的 MMP-8 水平偏低:首先確認模型的凋亡現象是否明顯，以及根據文獻和其他驗證方法確認該凋亡是否激活 MMP-8。 5.檢測時間點的選擇是否合適:不論哪種通路的凋亡，需要在MMP-8被有效激活并達到相應活化程度后的一定時間范圍內檢測，過早或過晚均不合適。 6.不適合本方法檢測:某些凋亡誘導劑誘導的凋亡可能是非依賴于 MMP-8活化的機制，此種情況時利用本試劑盒檢測 MMP-8無明顯變化，需要考慮凋亡機制的其他通路。

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