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采用高效液相色譜法測定食品中的水溶性著色劑
閱讀：1154 發布時間：2021-1-19摘要：本文采用乙腈-氨水溶液提取、Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱富集和凈化、Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱快速分離，建立了同時檢測食品中 9 種常用水溶性著色劑的液相色譜分析方法。該方法在 2.5-50 μg/mL 濃度范圍內線性相關性良好，相關系數 R2 ≥ 0.9998。對于冰淇淋和火腿腸這兩種基質，加標濃度為 2.5 mg/kg 和 5.0 mg/kg 的 9 種著色劑的平均回收率均處于 62.0%-117.3% 的范圍內，相對標準偏差為 0.4%-19.9% (n = 3)。9 種著色劑的方法檢測限 ≤ 0.083 mg/kg，在 15 min 內即可完成快速分離與高靈敏度分析。
前言：合成著色劑通常由苯、甲苯、萘等化工原料經過一系列有機反應獲得，以價格低廉、染色性能好且用量少等優點而廣泛應用于加工食品。對于加工食品中的著色劑，我國現行*和檢測方法分別為《食品安全標準 食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014)[1] 和《食品安全標準 食品中合成著色劑的測定》(GB 5009.35-2016)[2]。其中 GB 5009.35- 2016 規定的樣品前處理方法包括聚酰胺吸附法和液-液分配法，這兩種方法操作過程繁瑣，且對高脂肪、高蛋白的樣品提取效果不佳。本文采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱建立了食品中常用水溶性著色劑的樣品前處理方法，在對冰淇淋和火腿腸樣品中的 9 種水溶性著色劑的分析中獲得了良好的結果。
實驗部分：試劑和樣品實驗所用試劑和溶劑均為色譜純或分析純級。色譜純乙腈、甲醇購于迪馬公司，9 種著色劑標準品（檸檬黃、桔黃、靛藍、亮藍、莧菜紅、胭脂紅、新紅和酸性紅）購于 Dr. Ehrenstorfer 公司，實驗用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統現制備的高純去離子水。冰淇淋和火腿腸樣品為市售產品。儀器和設備 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統，配備以下模塊： – Agilent 1260 Infinity 二元泵（部件號 G4220A） – Agilent 1260 Infinity 標準自動進樣器（部件號 G4226A） – Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部件號 G1316C） – Agilent 1260 Infinity 二極管陣列檢測器（部件號 G4212A）
樣品提取與凈化：取 1.0 (±0.1) g 食品樣品于具塞離心管中，加 10 mL 提取液（濃氨水:水:乙腈=2:23:75，v/v/v）振搖提取 2 min，4 °C 8000 r/min 離心 10 min，取 5 mL 上清液至另一具塞離心管中并加 10 mL 水混勻，用甲酸調節 pH 至 2.0，4 °C 8000 r/min 離心 10 min，取上清液待凈化。采用 Agilent Bond Elut PSA 固相萃取小柱（部件號 12102042）進行凈化，操作流程如圖 1 所示。
液相色譜條件色譜柱： Agilent Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 100 mm, 2.7 μm （部件號 695975-902）柱溫： 35 °C 進樣量： 10 μL 流動相： A) 20 mmol/L 乙酸銨水溶液（用乙酸將 pH 調節至 5.0） B) 乙腈流速： 1.0 mL/min 梯度洗脫： 時間 (min) B（%） 0.0 2 6.0 30 11.0 90 11.5 100 12.0 2 15.0 2 檢測波長： 425 nm 檸檬黃 630 nm 靛藍、亮藍 500 nm 新紅、莧菜紅、胭脂紅、桔黃、酸性紅
標準曲線的繪制以超純水為溶劑，分別取一定量的著色劑標準品，配制得到濃度分別為 2.5、5.0、10.0、25.0 和 50.0 μg/mL 的混合標準溶液。取 10 μL 各種濃度的混合標準溶液進行測定，分別以 9 種著色劑在特定波長下的峰面積對濃度繪制標準曲線。
結果與討論提取液優化本文采用乙腈比例較高的堿性溶液（濃氨水:水:乙腈=2:23:75， v/v/v）提取冰淇淋和火腿腸中的水溶性著色劑，以便獲得高的提取效率。如果待測食品中的油脂含量不高，也可適當調整為采用水比例更高的提取液。固相萃取方法優化由于 9 種水溶性著色劑的化學結構中均含有芳香環結構和磺酸根基團，因此本文分別考察了非極性、強陰離子交換和弱陰離子交換三種固相萃取吸附模式，結果發現弱陰離子交換固相萃取在吸附強度和重現性方面表現出色，故選擇弱陰離子交換模式來萃取和凈化食品中的水溶性著色劑。為確保 9 種著色劑實現可靠的回收，本文針對提取液、活化液、上樣液、淋洗液、洗脫液的 pH 和離子強度均進行了細致的優化，終確定的固相萃取流程如圖 1 所示。色譜條件選擇本文選擇常用的十八烷基鍵合硅膠色譜柱進行液相色譜分離[2、3、4] ，結果發現色譜柱填料是否封端以及流動相的 pH 對著色劑（尤其是莧菜紅、檸檬黃和胭脂紅）的峰形影響顯著，其原因可能在于強陰離子磺酸根容易導致次級相互作用。因此，終選擇經過充分封端的 Poroshell 120 EC-C18 色譜柱，并將乙酸銨緩沖液的 pH 調節至 5.0，由此有效抑制了峰拖尾現象，使 9 種著色劑均可獲得優異的峰形，同時提高了分離度。檢測波長的確定通過二極管陣列檢測器全光譜采集，確定 9 種著色劑的檢測波長。結果發現，盡管 9 種著色劑在 254 nm 波長下的響應較高，但基線波動和雜質峰干擾現象較明顯，在可見波長下則具有更高的選擇性。1.25 μg/mL 混合標準溶液的色譜圖如圖 2 所示， 9 種著色劑的檢測波長分別為：檸檬黃，425 nm；靛藍和亮藍，630 nm；新紅、莧菜紅、胭脂紅、桔黃和酸性紅， 500 nm。