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三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀統(tǒng)測定人尿中蛋白同化制劑
閱讀：1000 發(fā)布時(shí)間：2022-8-25前言 在體育賽事中，為非法提高運(yùn)動(dòng)員的成績?yōu)E用藥物是世界反興feng劑機(jī)構(gòu)（WADA）嚴(yán)令 禁止的。WADA 每年都要公布違禁藥物清單 [2]，并建立每個(gè)違禁藥物的允許xian量 （MRPL）[3]。清單包括了幾百種化合物，可分為 11 種不同的類別。盡管 WADA 從 1998 年成立以來付出了很大努力，但蛋白同化制劑作為一類濫用藥物，其陽性檢出率 始終維持著越來越高的趨勢(shì)。由于蛋白同化類固醇激素代謝物，無論是外源性的還是內(nèi) 源性的，均有可能存在于人尿中，對(duì)這類化合物的檢測是一項(xiàng)艱巨的分析挑戰(zhàn)。 2 由于通過 WADA 認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室都被要求證明可以在 MRPL 水平 上對(duì)所有違禁藥物進(jìn)行常規(guī)篩查，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都創(chuàng)建了特定的 分析方法。這種反興feng劑檢測方法目前大多以兩種儀器設(shè)備為 基礎(chǔ)：單四極桿 GC/MS 系統(tǒng)和三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)。
然而，現(xiàn)在這個(gè)普遍采納的方案可能要發(fā)生改變。安捷倫 7000 系列三重四極桿 GC/MS 聯(lián)用系統(tǒng)采用 SRM 模式，可以極大地 提高違禁藥物的檢測靈敏度。應(yīng)用此儀器為平臺(tái)已經(jīng)建立了某 些特定類固醇（甲醇和脫氫氯甲基睪酮的代謝物）的長期檢測 方法 [4]，完成 150 種禁用藥物的復(fù)雜檢測僅需要 8 分鐘 [5]。 從實(shí)用角度出發(fā)，三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀GC/MS 篩查方法必須滿足兩方面 要求： 1. 可以檢測到 GC/MS 和 LC/MS/MS 無法檢測的 MRPL 水 平的化合物，例如 2 ng/mL的 17a-甲基-5b-雄烷-3a,17b二醇（甲睪酮的代謝產(chǎn)物） 2. 可以在苛刻的情況下證明其穩(wěn)定性 本應(yīng)用介紹了使用 7000 系列三重四極桿 GC/MS 系統(tǒng)在 7.3 分 鐘內(nèi)篩查和驗(yàn)證 7 種蛋白同化制劑的檢測方法 [1]，選定的目標(biāo) 物包括 17a-甲基-5b-雄烷-3a、17b-二醇以及其他蛋白同化制 劑，使用三重四極桿 GC/MS/MS 檢測這些化合物可獲得比傳 統(tǒng) GC/MS 和 LC/MS/MS 更全面的信息。方法的穩(wěn)定性通過兩 個(gè)星期內(nèi)對(duì)西班牙第十六屆泛美運(yùn)動(dòng)會(huì)興feng劑控制中收集到的 1367 個(gè)樣本分析進(jìn)行了驗(yàn)證。
實(shí)驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)品和試劑 甲睪酮用作內(nèi)標(biāo)物，克倫特羅來自 Sigma 公司（圣路易斯市， 密蘇里州，美國），17a-甲基-5b-雄烷-3a,17b-二醇，3a-羥基 康力龍，16a-羥基呋咱甲氫龍，甲雄烯二醇，19-去甲雄酮和 19-去甲原膽烷醇酮購于 National Measurement Institute （Pymble，澳大利亞），β-葡萄糖醛酸酶制劑（E. Coli K12） 購于 Roche Diagnostics GmbH （Mannheim，德國），分析純 磷酸氫二鈉、磷酸氫鈉、甲基叔丁基醚、氫氧化鉀，碘化銨，乙 硫醇和甲醇購于 Merck 公司（Darmstadt，德國）。N-甲基-N- （三甲基硅烷基）三氟yi酰胺（MSTFA）購于 MachereyNagel （德國），超純水用 Millipore Milli-Q Integral A 10 超純 水系統(tǒng)制備。
儀器 本研究使用 7890 系列 GC 與 7000 系列三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系 統(tǒng)，配置分流/不分流毛細(xì)管色譜柱進(jìn)樣口，使用選擇反應(yīng)監(jiān)測 采集模式，儀器條件列于表 1。
樣品制備 向尿樣（2.5 mL）中加入 1 mL 磷酸鹽緩沖溶液（1M，pH7）， 用 25 µL b-葡萄糖醛酸酶制劑在 55 °C 下培養(yǎng) 1 h。將樣品冷卻 至室溫后，加入 135 µL KOH （5M）將 pH 調(diào)節(jié)至 9.5，再加入 5 mL甲基叔丁基醚進(jìn)行液-液萃取。離心后，將有機(jī)層蒸發(fā)至干， 加入 59 µL MSTFA-NH4I-乙硫醇（100:2:6,v/w/v）在 60 °C 衍 生化 30 min，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中。
采集參數(shù) 本分析使用的安捷倫三重四極桿 GC/MS 系統(tǒng)參數(shù)列于表 2。
結(jié)果 方法開發(fā) 質(zhì)譜條件優(yōu)化過程分兩步進(jìn)行。首先，采集每個(gè)化合物衍生化標(biāo) 準(zhǔn)溶液的全掃描譜圖。分別采集全掃描譜圖中的主要母離子在 5 個(gè)不同碰撞能量下的子離子質(zhì)譜圖。通過這些研究確定母離子和 子離子在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM）下的最佳儀器條件。 通過分析空白尿樣萃取液和基體 5 倍允許限liang（MRPL）加 標(biāo)萃取液對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行最終確定。對(duì)每一個(gè)可能的母離子，都 要在 5 個(gè)不同的碰撞能量下獲取不同的子離子，包括前期實(shí)驗(yàn)確 定的最佳能量值。最后確定獲得最大信噪比（S/N）而非最大絕 對(duì)響應(yīng)的參數(shù)為參數(shù)，因?yàn)榛w和內(nèi)源性類固醇的背景噪聲 會(huì)產(chǎn)生顯著的影響。為了提高方法整體的定性能力，每個(gè)化合物 優(yōu)化確定兩個(gè)躍遷，表 2 匯總了為每個(gè)化合物建立優(yōu)化條件后的 分析結(jié)果。