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漆酶（Laccase）試劑盒說明書微板法
閱讀：236 發(fā)布時間：2024-1-5本試劑盒僅供科研使用
漆酶（Laccase）試劑盒說明書 （貨號：WS1450W 微板法 96 樣）
一、產(chǎn)品簡介： 漆酶（EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶家族，廣泛分布于真菌 和高等植物中，具有較強的氧化還原能力，在紙漿生物漂白，環(huán)境污染物降解和木質(zhì)纖維 素降解以及生物檢測方面有非常廣泛的應用。 漆酶分解底物 ABTS 產(chǎn)生 ABTS 自由基，在 420nm 處的吸光系數(shù)遠大于底物 ABTS， 測定 ABTS 自由基的增加速率，可計算得漆酶活性。
二、試劑盒組分與配制 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 12mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉劑落到底部， 再加 5.5mL 蒸餾水充分溶解，4℃ 保存一周，若變色則不能使用。
三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋。
四、漆酶活性檢測： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備 ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取 上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取 500 萬細胞加入 1mL 提取液，冰 浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；12000rpm，4℃ 離心 10min，取上清置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 420nm。 ② 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 30 試劑一 120 試劑二 50 25℃，立即于 420nm 處讀取吸光值 A1， 反應 5min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】若△A 差值較小，可增加樣本量 V1（如由 30μL 增至 60μL，則試劑一相應減少） 或延長反應時間 T（如由 5min 增至 15min），則改變后的樣本體積 V1 和反應 時間 T 則代入計算公式重新計算。本試劑盒僅供科研使用 2 五、結果計算： 1．按照蛋白濃度計算: 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個酶活力單位。 漆酶活性(nmol/min/mg prot)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=74.07×△A÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計算: 酶活定義：每克樣品每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個酶活力單位。 漆酶活性(nmol/min/g 鮮重)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=74.07×△A÷W 3．按照細胞數(shù)量計算: 酶活定義：每 104個細胞每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個酶活力單位。 漆酶活性(nmol/min/104 cell)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷(細胞數(shù)量×V1÷V)÷T =74.07×△A÷細胞數(shù)量 4．按照液體體積計算: 酶活定義：每毫升液體每分鐘氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量為一個酶活力單位。 漆酶活性(nmol/min/mL)=[△A÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=74.07×△A ε---ABTS 摩爾消光系數(shù)：36×103L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V2---反應總體積，0.2mL=2×10-4L； V1---反應中樣本體積，0.03mL； V---加入提取液體積，1mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應時間，5min； Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。