嘌呤霉素
別名 : 二鹽酸嘌呤霉素；嘌呤霉素鹽酸鹽 英文名稱 : Puromycin CAS : 58-58-2 分子式 : C22H29N7O5·2HCl 分子量 : 544.44 儲存條件 : -20℃ 危險代碼 : R:22 純度 : ≥98%（TLC） 外觀（性狀） : 白色或白中帶有黃色的粉末 單位 : 支

嘌呤霉素

• 別名 : 二鹽酸嘌呤霉素；嘌呤霉素鹽酸鹽
• 英文名稱 : Puromycin
• CAS : 58-58-2
• 分子式 : C22H29N7O5·2HCl
• 分子量 : 544.44
• 儲存條件 : -20℃
• 危險代碼 : R:22
• 純度 : ≥98%(TLC)
• 外觀（性狀） : 白色或白中帶有黃色的粉末
• 單位 : 支

• 蛋白質合成抑制劑。抑制細菌、藻類原生物和哺乳動物細胞生長。

  嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑鏈霉菌（Streptomyces alboniger）發酵代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質合成而殺死革蘭氏陽性菌，各種動物和昆蟲細胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結合后，不會參與隨后的任何反應，從而導致蛋白質合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

  嘌呤霉素產生菌Streptomyces alboniger內發現的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉移酶（PAC），賦予機體對嘌呤霉素產生抗性。這一特性如今普遍應用于篩選特定攜帶pac基因質粒的哺乳動物穩定轉染細胞株。

  嘌呤霉素在細胞穩轉株篩選中的普遍應用與慢病毒載體的特性有關，現在商業化的慢病毒載體多數都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉化攜帶pac基因質粒的大腸桿菌菌株。

  溶解性：溶于水，參考濃度50mg/ml。

• 嘌呤霉素

  使用方法

  1.建議使用濃度

  哺乳動物細胞：1-10 μg/mL，濃度需要殺滅曲線來確定；

  大腸桿菌：LB瓊脂培養基篩選穩定轉化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL。注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩轉株需要精確的pH值調節，而且受宿主細胞本身的影響。

  2.溶解方法

  用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的儲存液。

  3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉染或者慢病毒轉導為例）

  嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關。為了篩選到穩定表達的shRNA細胞株，確定殺死未轉染/轉導細胞的低濃度嘌呤霉素至關重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線（kill curve）。

  1） Day 1：24孔板內以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔以進行后續的梯度實驗。37℃細胞孵育過夜；

  2） Day 2：a）準備篩選培養基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基（如0-15μg/mL，至少5個梯度）；b）往孵育過夜后的細胞內更換新鮮配制的篩選培養基；之后37℃孵育細胞；

  3） Day 4：更換新鮮的篩選培養基，并觀察細胞存活率。

  4） 根據細胞的生長狀態，約2-3天更換新鮮的篩選培養基；

  5） 每日監測細胞，觀察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內有效殺死非轉染或者所有非轉導細胞的藥物低濃度。

  4. 哺乳動物穩定轉染細胞株的篩選

  等轉染含有pac基因的質粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養基中增殖，以篩選出穩定轉染子。

  1）細胞轉染48h后，將細胞（原樣或稀釋）置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養。

  注意：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用明顯。細胞過于密集，抗生素產生的效力會明顯下降。進行細胞分盤使其密度不超過25%。

  2）每隔2-3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養基。

  3）篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細胞系和轉染篩選效率。注意：每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

  4）轉移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養皿中，用選擇培養基繼續培養7天。此次富集培養是為日后的細胞毒性實驗做準備。

  注意事項

  1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

  2）嘌呤霉素為有毒化合物，操作時請小心拿放。