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BUNSEN本生小課堂:ELISA試劑盒測定與單克隆抗體的效價關(guān)系

時間:2023/6/29閱讀:960
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  BUNSEN本生小課堂:ELISA試劑盒測定與單克隆抗體的效價關(guān)系


  一、實驗?zāi)康?/p>

  1、深入了解ELISA法測定抗體效價的原理。

  2、掌握ELISA法測定單克隆抗體效價的方法。

  二、實驗原理

  ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。ELISA試劑盒免疫酶技術(shù)是將酶標記在抗體/抗原分子上,形成酶標抗體/酶標抗原,稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反 應(yīng)后,作用于底物使之呈色,根據(jù)顏色的有無和深淺,定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術(shù)的一種,其特點是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體,使之固相化,免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗 滌,這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系,也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中。酶促反應(yīng)只進行一次,而 抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進行一次或數(shù)次,即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應(yīng)。

  目前常用的幾種ELISA方法有:測定抗體的間接法,測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。ELISA試劑盒其主要過程為:首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi),加待測抗體,保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì),加酶標抗抗體,保溫后洗滌,加底物保溫30分鐘后,加酸或堿終止酶促反應(yīng),用目測或光電

  比色測定抗體含量。

  三、操作步驟

  ①抗原包被:兔抗人IgG 作為抗原,用包被液l:8000稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中。4℃放置過夜。

  ②洗滌:次日傾去凹孔內(nèi)的液體,洗滌液洗3次。

  ③封閉:加l00μL/孔封閉液,室溫放置0.5h.

  ④洗滌:用洗滌液洗3次。

  ⑤加待測樣品(一抗):將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1:2或1:10),100μL /孔加到 已包被的板上,每個樣品平行做兩份,PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育 1~2h。

  ⑥洗滌:用洗滌液洗3次。

  ⑦加酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP,用封閉液l :8000稀釋,100μL/孔,加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

  ⑧洗滌:用洗滌液洗5次,蒸餾水洗2次。

  ⑨顯色:加新鮮配制的底物溶液100μL/孔,室溫暗處放置5~30min,顯示藍色。

  ⑩終止反應(yīng)、比色:加50μL/孔終止液。ELISA試劑盒顏色變黃;用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值,陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測

  樣品的效價。

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