流動相是影響液相色譜的關鍵因素。一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有機溶劑或它們的混合液。但是如何配制，選擇配制的方法不同，分析結果特別是保留時間，是會有顯著差別的。高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有機溶劑或它們的混合液，水性溶劑也常用于緩沖液。常因資料上表示的內容和實際的配制方法不同，而產生流動相的差異，影響了色譜圖和分析結果。一般來說，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）進行。溶液的體積因溫度而變化，所以按重量比混合可調制再現性較好的混合溶劑，但由于操作較麻煩，通常多用體積比混合。只要沒有特別標明，就可按體積比進行混合，但在特殊情況下，如胺類粘度高的溶液混合時，有時用重量—體積比（W/V）的方法。
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。流動相溶解度達不到要求時，盡量選用流動相中含有的比例較大的成分，以減輕進樣對流動相的影響造成基線不穩。
b、流動相與樣品不產生化學反應，選用流動相配置對色譜峰影響最小。
c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。流動相組成溶劑均達不到要求時，選取的溶劑應保證在設定波長內無紫外吸收。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
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