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細胞凋亡檢測科研實驗技術服務介紹
閱讀：106 發布時間：2024-9-19
應用簡介
細胞凋亡是細胞主動實施的一種程序性死亡，是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發育、組織修復、內環境的穩定等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。
技術原理
AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。因此AnnexinV作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將AnnexinⅤ進行熒光素FITC標記，以標記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙錠（PropidiumIodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜使細胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。
基本特征：
細胞凋亡具有特定形態學和生物化學特征：
1、形態學特征：凋亡常發生于單個細胞，其形態變化分3個階段：第一階段可見凋亡細胞與相鄰細胞分離，細胞皺縮，染色質濃縮，聚集于核膜周圍呈半月形，亦可發生核斷裂，核仁裂解。第二階段可見細胞表面突出，分成多個膜包繞小體，含有部分核和／或完整的細胞器，稱為凋亡小體（apoptosisbodies）。第三階段，凋亡小體被組織細胞或吞噬細胞吞噬降解。在有內皮的腔中如膽管、凋亡小體可以排入腔內；在組織培養中，凋亡細胞與鄰近細胞和培養基質相分離。整個凋亡過程在幾小時內全部完成。與壞死相比，凋亡的顯著特點是整個過程中漿膜保持完整，減少了細胞成分外漏，因此，沒有或僅有很輕炎癥反應。而壞死是病理因素作用使細胞膜失去完整性而引起細胞溶解，通常波及相鄰細胞，表現為細胞腫脹，細胞器溶解，細胞膜破裂，伴有組織炎癥。由于凋亡過程迅速，凋亡小體較小，因此，在光鏡下不易發現細胞凋亡。
2、生物化學特征：細胞凋亡的生物化學特征是DNA斷裂，這種斷裂不是隨機的，它與細胞內核酸內切酶的激活有關。在內切酶作用下，細胞核中的DNA裂解成核小體大小的片段，每個核苷酸片段大約有180～200個堿基對。在瓊脂糖凝膠電泳上出現典型的階梯樣的DNA區帶。而壞死的細胞，DNA被溶酶體釋放的多種水解酶隨機降解，DNA電泳呈模糊、微弱的蹤跡，不能形成階梯狀，以此可區別細胞凋亡和壞死。但是核小體斷裂是凋亡的晚期表現，并不普遍存在。
實驗方法
1、誘導培養細胞時間要準確。
2、AnnexinV是光敏物質，在操作時要注意避光。
3、細胞凋亡是一個動態的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變，熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。
4、整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。